陈 峥，刘 波，朱育菁，潘志针，刘 欣，刘丹莹

(福建省农业科学院农业生物资源研究所 350003)

青藏高原包括藏北高原、藏南谷地、柴达木盆地、祁连山地、青海高原和川藏山峡谷区等，被誉为地球“第三极”和“世界屋脊”，是地学、生物学、资源与环境等研究领域的重点地区和天然实验室。福建省农业科学院芽胞杆菌研究团队(以下简称“研究团队”)加入由中国科学院微生物研究所组织的青藏高原联合科考队，在国内首次系统开展青藏高原芽胞杆菌资源的采集、分离和鉴定工作。2013-2016年研究团队系统开展了青藏高原芽胞杆菌资源考察，收集了海拔500～5100 m的高原荒漠、峡谷、草甸、温带森林、亚热带雨林、热带雨林等生境下的芽胞杆菌资源，系统调查青藏高原极端环境条件下存活的芽胞杆菌资源情况，通过菌株分离筛选与科学鉴定，发现未见报道的新种，进行功能开发利用；并建立起青藏高原芽胞杆菌资源名目与资源库，完善中国芽胞杆菌分类体系。

研究团队与中国科学院微生物研究所合作开展“青藏高原及新疆地区特色微生物资源与多样性调查”项目的研究。自2013年以来，研究团队系统开展了青藏高原地区芽胞杆菌资源采集工作，包括青藏野外科学考察芽胞杆菌资源采集、川青野外科学考察芽胞杆菌资源采集、川滇野外科学考察芽胞杆菌资源采集、青甘野外科学考察芽胞杆菌资源采集、川藏野外科学考察芽胞杆菌资源采集等。采集和分离到的青藏高原芽胞杆菌菌株保存于青藏高原芽胞杆菌资源库，截至2017年3月共保存资源载体(主要是土壤)2827份，分离菌株8532株，其中初步鉴定菌株811株、疑似新种43个。

1 青藏高原芽胞杆菌样品采集路线

研究团队于2013-2016年进行连续4年的样品采集，具体的采集路线及入库样品数归纳于表1。

1.1 2013年青藏高原芽胞杆菌资源调查与采集

设计3条采集路线，一是西藏羌塘地区，途经纳木错、双湖、尼玛、申扎、墨竹工卡、林芝等地，共采集土壤样品268份；二是四川阿坝-青海班玛地区，途经九寨沟、松潘、阿坝、斑玛、色达、道孚、康定、泸定等地，共采集土壤样品263份；三是青海可可西里，途经互助北山、尕海湖、德令哈、青海湖、可可西里等地，共收集土壤样品384份。

1.2 2014年青藏高原芽胞杆菌资源调查与采集

设计2条采集路线，一是川滇地区，途经洱源、丽江、香格里拉、白茫雪山、稻城、理塘、新都桥、康定等地，共采集土壤样品509份；二是西藏林芝地区，途经林芝、鲁朗、波密、通麦、墨脱、德行、察隅等地，共采集土壤样品131份。

1.3 2015年青藏高原芽胞杆菌资源调查与采集

设计2条采集路线，一是青甘地区，途经互助林场、孟达天池、祁连山、大黑沟等地，共采集土壤样品902份；二是西藏山南地区，途经林芝、山南、日喀则等地，共采集土壤样品194份。

1.4 2016年青藏高原芽胞杆菌资源调查与采集

参加川藏地区318路线采集，途经理塘、亚丁、雅江等地，共采集土壤样品176份。

表1 青藏高原芽胞杆菌样品采集路线与土壤样品数量

2 土壤样品分布

2.1 地理分布

研究团队从青藏高原6个地理板块中采集了丰富的土壤样品，其中来自祁连山地的土壤样品最多，为902份；其次是来自川藏山峡谷区的土壤样品，为872份；而青海高原、藏北高原和藏南谷地的土壤样品分别为384份、268份和325份；来自柴达木盆地的样品最少，为76份(表2)。

2.2 海拔分布

在青藏高原采集的土壤资源中，土壤样品的海拔分布以海拔2900～3200 m的样品最多，为604份，占总数的21.37 %；其次为海拔3300～3600 m的样品，为522份，占样品总数的18.46%；极端海拔(5000～5100 m)的样品有34份，海拔低于2200 m的样品有153份，分别占样品总数的1.20%和5.41%(表3)。采集生境包括：高原荒漠、高山森林灌丛、峡谷区、草甸、森林、温带森林、湿地、亚热带雨林、热带雨林等(图1-4)。

表2 土壤样品的地理分布

注：*青藏高原地理特征参考百度百科中“青藏高原”“藏北高原”“藏南谷地”“青海高原”等词条。

3 芽胞杆菌菌株保存与信息存档

3.1 芽胞杆菌菌株信息存档

对所采集土壤样品中的芽胞杆菌进行分离和保藏，并参照刘国红等[1]的方法，用16S rRNA进行初步鉴定。纯化后的芽胞杆菌菌株，按研究团队制定的条形码格式进行编号，而后通过微生物菌落拍照仪进行拍照，获得每株芽胞杆菌的菌落形态照片。其中，芽胞杆菌菌株信息(表4)包含了土样的入库编号、采集地点、生境类型、植被类型、经纬度、海拔、采样时间及采样人等。

3.2 芽胞杆菌菌株保存

表3 青藏高原土壤样品的海拔分布

表4 青藏高原芽胞杆菌资源主要信息

图1 草原草甸采集生境 图2 峡谷采集生境

图3 树林采集生境 图4 湖泊采集生境

图5 菌株超低温冰箱保存 图6 芽胞杆菌菌株保存

获得菌株编号后，采用-80℃甘油冷冻法进行保存(图5)。甘油和保存培养基按1∶4的比例配好后，进行高压灭菌20 min(图6)。

4 讨论

青藏高原是中国最大、世界海拔最高的高原，具有独特的地理位置和气候条件。目前针对青藏高原微生物多样性的研究主要集中在冰川冻土[2]、高寒草甸[3]、高原湖泊[4]等，而针对青藏高原芽胞杆菌的系统调查与研究，还未见报道。福建省农业科学院芽胞杆菌研究团队首次开展青藏高原芽胞杆菌资源考察，构建了青藏高原芽胞杆菌资源库。截至2017年3月，该资源库入库资源载体2827份，芽胞杆菌菌株8532株。并鉴定菌株811株，发现疑似新种43个。该研究为进一步系统查明青藏高原极端条件下存活的芽胞杆资源状况，发现未见报道的新种，建立起青藏高原芽胞杆菌资源名目与资源库，为完善中国芽胞杆菌分类体系奠定了基础。

[1]刘国红,刘波,陈倩倩,等.西藏尼玛县盐碱地嗜碱芽胞杆菌资源采集与鉴定[J].福建农业学报,2016,31(3):268-272.

[2]邢婷婷,刘勇勤,王宁练,等.青藏高原木孜塔格冰川、玉珠峰冰川及扎当冰川可培养细菌的生理特征[J].冰川冻土,2016,38(2):528-538.

[3]于健龙,石红霄.高寒草甸不同退化程度土壤微生物数量变化及影响因子[J].西北农业学报,2011,20(11):77-81.

[4]张红光,李琳,赵燕,等.青藏高原不同海拔湖水中可培养微生物的季节性变化[J].中兽医医药杂志,2013,32(3):49-55.

[5]刘波.芽胞杆菌 第一卷 中国芽胞杆菌研究进展[M].北京：科学出版社,2015.

[6]刘波.芽胞杆菌 第二卷 芽胞杆菌分类学[M].北京：科学出版社,2016.

[7]刘波.芽胞杆菌.第三卷 芽胞杆菌生物学[M].北京：科学出版社,2016.

[8]刘波,王阶平,陶天申,等.芽胞杆菌属及其近缘属种名目录[J].福建农业学报,2015(1):38-59.