蔺娜 宋欣伟 张缪佳

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是以多关节肿痛为主要表现的一种慢性、全身炎性的自身免疫性疾病，其病因机制不明，遗传因素、环境因素、炎症因素等均与RA发病有关。慢性滑膜炎症、滑膜增生、血管翳形成是RA慢性炎症阶段最突出的病理特征。炎症反应和血管形成是两个相互依赖的过程，这些因子相互调节，形成一个复杂的网络，促进RA的发生与发展[1]。尽管RA血管翳的发病机制尚不明确，但是目前有大量文献证实基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）和血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是与血管翳生成密切相关的细胞因子，主要通过作用于血管内皮细胞参与RA血管翳的生成[2-6]。但其与炎症反应阶段相关细胞因子的关系尚不清楚。IL-6是一种多效性前炎症细胞因子，在RA炎症反应阶段起着重要作用，且IL-6水平与疾病活动性及临床表现密切相关。前期研究证实，IL-6需与IL-6受体结合后才可发挥相应的生物学效应。IL-6有两种信号转导途径，其中研究最多的一种是IL-6需要与IL-6Rα直接结合，形成IL-6/IL-6α复合物后再与gp130结合形成高亲和力的复合物，从而发挥多种生物学效应[7]。另外一种途径是一种可溶形式的IL-6R（sIL-6R）与IL-6结合形成循环复合物，IL-6/sIL-6R复合物与表达gp130细胞结合，增加了对IL-6起反应的细胞种类[8]。研究证实，许多IL-6引起的炎症均是由sIL-6R介导的，因此IL-6/sIL-6R复合物才是重要的促炎症介质。目前抗IL-6Rα的人源化药物Tocilizumab（TCZ）已应用于临床，该药可减轻RA患者的症状，降低疾病的活动度，但也有一定不良反应，限制了该药在临床中的应用[9]。因此IL-6/sIL-6R复合物在RA发病机制中的研究显得更为重要。笔者探讨RA关节局部高表达的IL-6/sIL-6R复合物是否与VEGF及MMP-9表达相关，旨在为RA的发病机制提供依据，并探索新的药物治疗靶点。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂 人脐静脉内皮细胞（HUVECs）购自中科院细胞库，FBS购自美国Gibco公司，重组人IL-6、sIL-6R购自美国PeproTech公司，兔抗人MMP-9一抗购自美国Cell Signaling Technology公司；兔抗人VEGF一抗购自英国Abcam公司；羊抗人GAPDH单克隆抗体购自中国中杉金桥公司；Trizol购自美国Invitrogen公司；逆转录试剂盒购自日本TaKaRa公司；real-time PCR试剂盒购自美国ABI公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 将HUVECs置于含体积分数为10%FBS 和青/链霉素（青霉素 100U/ml，链霉素 100mg/ml）的DMEM培养基中，在温度为37℃，体积分数为5%CO2孵箱中培养。取对数生长期的HUVECs，接种于6孔板中，接种密度为 1×105/孔。饥饿 6h 后，用 0、10、20、40、80ng/ml不同浓度的IL-6联合sIL-6R 100ng/ml刺激细胞，培养24h后收集细胞，检测细胞mRNA水平及蛋白表达。

1.2.2 real-time PCR检测MMP-9及VEGF的mRNA表达 Trizol法提取总RNA，并将RNA反转录为cDNA。PCR反应体系：反应体积为5 μl，其中包括Power SYBR Green PCR Master Mix（2×）2.5μl，超纯水 1.25μl，上下游引物各0.125μl及稀释的cDNA 1μl。每组设3个复孔。扩增条件为：95℃ 10min，40 个循环（95℃ 15s，60℃1min）。以β-actin作为内参基因。引物由Invitrogen公司合成，序列如下：MMP-9：上游引物 5′-TGTACCGCTATGGTTACACTCG-3′，下游引物 5′-GGCAGGGACAGTTGCTTCT-3'；VEGF 引物序列为：上游引物 5′-GAGGAGCAGTTACGGTCTGTG-3′，下游引物 5′-TCCTTTCCTTAGCTGACACTTGT-3′；β-actin 引物序列为：上游引物 5′-ACTGGAACGGTGAAGGTGACC-3′，下游引物 5′-AGAGAAGTGGGGTGGCTTTT-3′。 所有扩增均在ABI 7900 real-time PCR仪上进行。反应结束后作溶解曲线。以目的基因的Ct值减去内参的Ct值为Δ内参，2-Δ内参值来表示目的基因mRNA表达水平的高低。

1.2.3 Western blot法检测MMP-9和VEGF蛋白的表达 提取标本总蛋白，以蛋白总含量20μg加样，经SDS-PAGE凝胶电泳后，将蛋白转移至PVDF膜上，封闭液封闭，4℃孵育一抗过夜，第2天TBST洗膜3次，15min/次，孵育二抗 2h，TBST 洗膜 3 次，15min/次，显影曝光，测定各条带吸光度值。

1.4 统计学处理 应用GraphPad Prism 5统计软件，计量资料以表示，不同浓度IL-6/sIL-6R复合物与空白组比较采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度IL-6/sIL-6R复合物与空白组 MMP-9及VEGF mRNA表达的比较 结果发现IL-6 40ng/ml+sIL-6R 100ng/ml组及 IL-6 80ng/ml+sIL-6R 100ng/ml组VEGF及MMP-9的表达较空白组明显升高，差异均有统计学意义（均P＜0.01），IL-6 20ng/ml+sIL-6R 100ng/ml组及IL-6 10ng/ml+sIL-6R 100ng/ml组较空白组间无统计学差异（P＞0.05）。另外HUVECs VEGF及MMP-9的表达与IL-6的刺激呈剂量依赖性。详见图1。

图1 不同浓度IL-6/sIL-6R复合物与空白组MMP-9及VEGF mRNA表达的比较（与空白组比较，*P＜0.05，**P＜0.01）

2.2 不同浓度IL-6/sIL-6R复合物与空白组MMP-9及VEGF蛋白表达的比较 结果发现IL-6 40ng/ml+sIL-6R 100ng/ml组及 IL-6 80ng/ml+sIL-6R 100ng/ml组VEGF及MMP-9蛋白的表达较空白组明显升高，差异均有统计学意义（均P＜0.05），IL-6 20ng/ml+sIL-6R 100ng/ml组及IL-6 10ng/ml+sIL-6R 100ng/ml组与空白组间比较无统计学差异（P＞0.05），且MMP-9表达与IL-6的刺激呈剂量依赖性。详见图2。

图2 不同浓度IL-6/sIL-6R复合物与空白组MMP-9及VEGF蛋白表达的比较（与空白组比较，*P＜0.05，**P＜0.01）

3 讨论

RA的发病机制涉及复杂的细胞免疫及体液免疫反应，包括免疫复合物形成、血管反应、淋巴细胞及单核细胞在滑膜的浸润等。这些浸润的细胞与滑膜细胞一起释放包括IL-6在内的多种促炎症介质，作用于滑膜内的其他细胞，形成滑膜及关节周围的持续炎症[1]。RA的滑膜改变可分为炎症期、血管翳形成期和纤维化三期。炎症期以IL-6为代表的炎症因子的作用结果[10]，血管翳形成期以VEGF及基质金属蛋白酶为主导[11-12]，本研究发现高表达的IL-6/sIL-6R复合物可促进内皮细胞VEGF及MMP表达，激活血管新生，加重关节软骨和骨质损伤，最终导致患者出现关节畸形。

RA患者血清及关节液中IL-6及sIL-6R明显升高，且IL-6及sIL-6R水平与慢性滑膜炎的局部关节症状及关节破坏程度显著相关[13-14]。研究表明，许多IL-6引起的炎症是由sIL-6R介导的，Hashizume等[15]研究发现，IL-6、sIL-6R或IL-1β可诱导核因子κB活化因子受体（RANKL）表达，进一步诱导破骨细胞活化，最终导致RA关节骨破坏，另外TNF-α和IL-17亦只有在sIL-6R存在时才能诱导RANKL的表达。Misato Hashizume等[16]研究证实IL-6/sIL-6R复合物而非IL-6可促进HUVECs的血管增生。而笔者前期研究发现，单独IL-6并不能刺激HUVECs表达VEGF及MMP-9。也有研究证实IL-6联合sIL-6R作用于滑膜内其他细胞，可引起滑膜及其他关节结构的持续炎症，加重关节局部的骨破坏。

VEGF是一类特异性血管生成因子，可以促进内皮，细胞的增殖和提高血管通透性，促进新生血管的形成，参与RA关节周围的血管翳生成，为滑膜细胞提供营养及氧，并招募炎症因子[17]。MMP-9是一类能有效降解细胞外基质及细胞膜成分的蛋白水解酶，同时也能释放生长因子、趋化因子和细胞因子等，其作用底物广泛，表达细胞众多，参与人体许多生理和病理过程[18]。Jackson等[19]研究发现，在MMP-9的作用下可导致慢性滑膜组织增生，表现为滑膜衬里细胞增生，炎性细胞浸润，滑膜下细胞增生和炎性细胞浸润及滑膜下层血管生成，增生的滑膜组织向软骨面生长，形成血管翳。

本研究证实IL-6/sIL-6R复合物而非IL-6可上调内皮细胞表达血管生成相关因子VEGF及MMP-9。可见IL-6和VEGF在RA发生、发展是级联先后出现的，IL-6/sIL-6R复合物可促进内皮细胞分泌VEGF和MMP-9，使内皮迁移和增殖，改变小血管通透性，导致血管翳形成，加重骨破坏。因此，IL-6/sIL-6R复合物在RA的炎症期及血管翳形成期起着承上启下的作用，在RA的发生、发展中起着重要的作用。

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