瓜蒌种子质量标准研究

2018-01-24，，，，，

种子 2017年11期

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(数字本草中医药检测有限公司，河北保定 071200)

瓜蒌为葫芦科栝楼属多年生攀援藤草本植物的果实，植物整株多处部位可入药，《中华人民共和国药典2015年版四部(9107通则)》规定，果实皮入药为瓜蒌皮，根入药为天花粉，种子入药为瓜蒌子。其中瓜蒌子富含油脂、甾醇类、蛋白质等成分，具有润肺化痰，滑肠通便之功效[1]和改善心血管疾病等保健功效[2]，开发潜力巨大，具有广阔的市场前景。目前瓜蒌的繁殖方式分为有性繁殖和无性繁殖2种，种植区多采用无性分根繁殖[3]，然而无性繁殖方式的繁殖系数低，且种质易退化[4]，导致所产的瓜蒌、瓜蒌皮、天花粉等药材质量难以保障，以种子作为栽培材料的有性繁殖方式则无此缺点。因此，开展瓜蒌种子质量标准研究不仅有利于生产，对天花粉、瓜蒌子等药材的质量控制也具有重要意义。

目前瓜蒌在全国均有分布，尤以河北安国一带种植历史悠久，种植面积广泛，故本研究以河北安国所产瓜蒌种子为重点，同时包括四川、江苏、河南等地所产瓜蒌种子。目前关于瓜蒌种子的研究主要集中在萌发特性[5]及成分分析[6]2个方面，尚未发现有关瓜蒌种子质量标准研究的报道。本研究先采用DNA条形码技术首先对收集的种子进行真实性鉴定，然后对12批种子净度、水分、生活力、发芽率等指标进行测定并分析，初步制定了瓜蒌种子质量标准，为进一步制定瓜蒌种子检验及质量分级地方标准或国家标准提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料

本实验包括19份实验样品，其中瓜蒌种子样品12份，双边栝楼(TrichosanthesrosthorniiHarms)的基原植物3份，栝楼(TrichosantheskirilowiiMaxim.)的基原植物2份，栝楼属近缘种湖北栝楼(Trichosant

表1 实验样品信息表

样品名称样品编号GenBank号来源瓜蒌种子GLZ01KY987477河北安国药材市场瓜蒌种子GLZ02KY987478河北安国药材市场瓜蒌种子GLZ03KY987479河北安国药材市场瓜蒌种子GLZ04KY987480河北安国药材市场瓜蒌种子GLZ05KY987481河北安国药材市场瓜蒌种子GLZ06KY987482河北安国药材市场瓜蒌种子GLZ07KY987483河北安国药材市场瓜蒌种子GLZ08KY987484河北安国市祁州镇西河村瓜蒌种子GLZ09KY987485江苏宿迁瓜蒌种子GLZ10KY987486江苏宿迁瓜蒌种子GLZ11KY987487河南沐阳瓜蒌种子GLZ12KY987488四川成都栝楼(TrichosantheskirilowiiMaxim.)TX01KY987489河南南阳桐柏县栝楼(TrichosantheskirilowiiMaxim.)TX02KY987490四川成都双边栝楼(TrichosanthesrosthorniiHarms)SSN182-1KY987492湖北神农架双边栝楼(TrichosanthesrosthorniiHarms)SSN182-2KY987493湖北神农架双边栝楼(TrichosanthesrosthorniiHarms)SSN182-3KY987494湖北神农架湖北栝楼(TrichosantheshupehensisC.Y.chengetYueh)HBGL01KY987491湖北武汉王瓜(Trichosanthescucumeroides(Ser.)Maxim.)WG01KY987476江西赣州

heshupehensisC.Y.cheng et Yueh)和王瓜(Trichosanthescucumeroides(Ser.)Maxim.)的种子样品各1份。用于质量标准建立的样品编号为GLZ 01-12 ，共12批，所有样本均进行真实性鉴定，样品信息见表1。

1.2 种子取样

按照《GB/T3543.2—1995 农作物种子检验规程》中的四分法进行操作，直至获得测定各项指标所需的种子样品。

1.3 试验方法

1.3.1 瓜蒌种子真实性测定

采用DNA条形码技术对瓜蒌种子与同属的近缘种的种子进行真实性鉴别[7-8]。方法如下：

使用天根植物DNA提取试剂盒(DP 305)提取总DNA，再用通用引物ITS 2 2 F-3 R扩增其ITS 2序列，PCR反应体系为25μL，其中2×TaqPCR MasterMix 12.5μL，正反向引物(2.5μmol/L)各1μL，DNA模板约100 ng，其余用灭菌双蒸水补足25μL。扩增条件见《中华人民共和国药典2015年版四部(9107通则)》[1]。采用软件CodonCode Aligner V 4.2.4拼接正反向峰图，获得ITS 2间隔区序列，并将序列提交至GenBank。

登陆GenBank的Nucleotide数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore)下载栝楼及其近缘种长萼栝楼(TrichosantheslaceribracteaHayata)的ITS 2序列(HE 661336、38)；红花栝楼(TrichosanthesrubriflosThorel ex Cayla)的ITS 2序列(HE 661372-73、HQ 829639-42)。将所有序列导入软件MEGA 6分析比对，基于K 2 P模型和自举检验法(1 000次)，构建NJ系统发育树。

1.3.2 瓜蒌种子净度测定

根据瓜蒌种子的形态、色泽、大小特征，参考《国际种子检验规程》中对葫芦科净种子的相关规定[9]，除去杂质和其他植物种子，测定净种子的比例。

1.3.3 瓜蒌种子千粒重测定

采用五百粒法进行测定：从分好的样品中数出500粒作为1个重复，每批重复2次，称重，测得其平均值后乘以2即为瓜蒌种子的千粒重[4]。

1.3.4 瓜蒌种子水分测定

采用高温烘干法。每批样品2次重复，样品量2 g左右(精确至0.001 g)。温度设定为140～145 ℃，烘干时间为1 h，减少重量的百分率即为瓜蒌种子水分含量。

1.3.5 瓜蒌种子生活力测定

使用TTC法测定瓜蒌种子生活力。将分好的栝楼样品每份300～500粒，置于30 ℃的蒸馏水中预湿4 h。随机抽取200粒，分成2组，每组100粒。对种子进行纵切，选留其中较为完整的1/2，浸入0.5%的红四氮唑溶液中染色8 h[4]。

1.3.6 瓜蒌种子发芽率测定

采用砂床作为种子萌发基质。选择大小均匀，直径为0.05～0.80 mm砂粒，使用前先用蒸馏水冲洗并在140 ℃下干热灭菌2 h。种子先在室温浸泡24 h，然后使用40 ℃温水浸泡4 h。之后使用剪刀或刀片小心去除瓜蒌种子尖端的种皮(划伤的种子弃去不用)，使胚充分暴露。将处理好的种子置于砂质培养基中，上层覆盖约5 mm的沙粒，并用喷壶浇水，使其含水量在砂床饱和含水量的80%。将3 d内无新的种子萌发的时间作为实验终点[5]。

图1 瓜蒌种子及其近缘种的系统聚类树

1.4 统计方法

采用SPSS 19.0软件对数据进行整理和分析。方差分析采用Duncan法。

2 结果与分析

2.1 瓜蒌种子真实性测定

基于建树分析的系统聚类分析是DNA 条形码鉴别方法中较为直观地反映物种水平分辨效果的方法，能有效地为不同类群物种鉴定提供依据。如图1所示，(T.kirilowii)与双边栝楼(T.rosthornii)的序列聚为一支，说明二者的亲缘关系较近；栝楼(T.kirilowii)与双边栝楼(T.rosthornii)能与其同属的混伪品聚为不同的分支，说明栝楼(T.kirilowii)与双边栝楼(T.rosthornii)能与同属近缘种王瓜等明显的区分开，表明基于ITS 2序列的DNA条形码技术能够准确鉴定瓜蒌种子与其近缘种。

2.2 瓜蒌种子净度测定

净度是描述正常种子的重量占供试种子重量的参数，净度的高低主要影响机播过程中的种子出苗率，净度低时会造成田间缺苗断条，从而影响产量[10]。结果表明，种子重量增失不足初始重量的5%，净度分析有效。12批瓜蒌种子净度很高，均在96%以上，平均值为97.31，95%的置信区间的上下限分别为97.67%和96.96%，见表2和表5。

2.3 瓜蒌种子千粒重测定

千粒重是以克为单位表示每千粒种子重量的指标。它体现着种子大小和饱满程度，是检验种子质量和作物考种的重要内容，同时对预测田间产量具有重要意义[11]。本研究测定12批瓜蒌种子中，以四川成都千粒重最大，为223.85 g，与其他处理相比均达到极显著差异；河南沐阳的最小，为123.75 g，仅占前者的55.28%；河北安国瓜蒌种子千粒重在两者之间，且各批次间变化幅度较大。12批瓜蒌种子千粒重平均值为181.60，95%的置信区间的上下限分别为166.44 g和195.37 g，与方差分析中B水平的结果(179.33～193.60 g)较为接近，详见表3和表5。因此，瓜蒌种子千粒重的质量指标可定为≥180 g，在此标准下，12批瓜蒌种子千粒重的合格率为75%。

表2 瓜蒌种子净度

编号初始重量(g)净种子(g)杂质(g)破损粒(g)增失重(g)净度(%)GLZ01249.63243.542.833.150.1197.60GLZ02234.54227.203.064.130.1596.87GLZ03252.47243.105.983.320.0796.93GLZ04251.99245.275.411.260.0597.35GLZ05252.72247.431.763.500.0397.92GLZ06254.37248.363.262.550.2097.71GLZ07248.28244.422.531.300.0398.46GLZ08255.23247.974.172.780.3197.27GLZ09245.35235.924.564.720.1596.22GLZ10260.84254.464.561.720.1097.59GLZ11258.87251.815.241.750.0797.30GLZ12246.33237.663.425.110.1496.54

2.4 瓜蒌种子水分含量测定

水分是用于表达种子干燥程度的指标。水分高低主要受环境和人为因素影响，可以通过调整加工方式来改变。在不损害种子活力的前提下，水分含量越低，种子的储藏性能和寿命越长，因此种子质量标准中往往限制最高值[12]。结果显示，编号为GLZ 06的瓜蒌种子含水量最低，为5.38%，而编号为GLZ 08的瓜蒌种子水分含量最高，为8.62%，不同批次样品间水分差异显著。12批瓜蒌种子水分平均值为6.64%，95%的置信区间的上下限分别为6.21%、7.09%，与方差分析中B水平的结果(6.77%～6.97%)较为接近，详见表4和表5。因此，瓜蒌种子水分的质量指标可定为不超过7.0%。在此标准下，12批瓜蒌种子水分的合格率为83%。

表3 瓜蒌种子千粒重

编号千粒重(g)2次重复差数差数与平均数之比(%)GLZ01193.60Bb2.782.87GLZ02179.33Bc2.292.55GLZ03144.58Cd3.524.87GLZ04186.84Bbc4.364.67GLZ05181.98Bbc3.323.65GLZ06191.10Bbc3.303.45GLZ07183.73Bbc3.553.86GLZ08187.59Bbc3.814.06GLZ09185.57Bbc2.632.83GLZ10180.15Bc4.494.98GLZ11124.20De2.123.41GLZ12228.05Aa2.352.06

注：同列大写字母表示p<0.01水平下的差异显著性，同列小写字母表示p<0.05水平下的差异显著性。下同。

表4 瓜蒌种子水分、生活力、发芽率检测

编号水分(%)生活力(%)发芽率(%)GLZ016.77CDd88Bb41BbGLZ026.38FGf89Bb31BCcGLZ036.98Cc87Bb33BCbcGLZ045.99Hg88Bb35BbcGLZ056.15GHg95Aa65AaGLZ065.38Ih89Bb34BbcGLZ076.97Cc57Cc17DdGLZ088.62Aa95Aa60AaGLZ096.09Hg60Cc21CDdGLZ106.64DEde39Dd16DdGLZ116.47Fef59Cc21CDdGLZ127.31Bb87Bb38Bbc

2.5 瓜蒌种子生活力测定

生活力是表示种子发芽潜在能力和种胚所具有的生命力的重要指标，尤其对于重度休眠的种子，生活力数据可以代替发芽率使用[13]，研究发现不同来源瓜蒌种子生活力差异达到极显著水平，其中编号为GLZ 05的瓜蒌种子生活力最高，达到95.3%，编号为GLZ 10的江苏宿迁种子生活力最低，仅为48.3%，各批次的瓜蒌种子生活力差异显著。12批瓜蒌种子生活力平均值为77.67%，95%的置信区间的上下限分别为67.72%、87.28%，与方差分析中B水平的结果(68%～87%)较为接近，详见表4和表5。因此，瓜蒌种子生活力的质量指标可定为不低于85%。在此标准下，12批瓜蒌种子生活力的合格率为66.7%。

表5 瓜蒌子各质量指标均值统计结果

质量指标均值自助法偏差标准误差95%置信区间下限上限净度97.310.00530.173596.9697.67千粒重181.60-0.21057.2822166.44195.37水分6.64-0.00340.22546.217.09生活力77.670.49674.941967.7287.28发芽率34.33-0.00514.255126.5943.33除非特别注明,自助法结果基于1000个样本量

2.6 瓜蒌种子发芽率测定

发芽率是衡量种子是否具有生活力的直接指标，并直接影响种子田间出苗率，对确定种子价格，种子等级划分具有重要意义。研究结果显示，不同批次间种子发芽率差异达到极显著水平，同时由于瓜蒌种子的休眠特性[14]，整体发芽率较低，最高的也仅为65%，最低不足25%。12批瓜蒌种子发芽率平均值为34.33%，95%的置信区间的上下限分别为26.59%、43.33%，与方差分析中B水平的结果(31%～41%)相近，详见表4和表5。因此，瓜蒌种子发芽率的质量指标可定为不低于30%。在此标准下，12批瓜蒌种子发芽率的合格率为66.7%。

3 讨论与结论

种子作为中药材生产的物质基础，其质量好坏直接影响到药材的安全性、稳定性和有效性，进而影响整个中医药产业的持续健康发展[15]，因此建立及推广药材种子标准，能有效抑制药材种子市场乱象，促进中药材产业规范化和标准化[16]。与农作物相比，中药材种子质量的研究严重滞后，仅人参具有国家标准，黄芪、板蓝根、丹参等少数品种建立了地方标准，但大部分中药材种子既没有强制性的国家标准，也缺乏针对性的地方、行业标准，导致中药材种子市场种源混乱，新旧种掺杂等乱象[17]。其中，瓜蒌种子质量在种植领域尚未发现国家或地方标准，也未发现相关文献报道。

瓜蒌种子常见混伪品有湖北栝楼的种子、王瓜的种子等，其中湖北栝楼广泛分布于湖北、湖南、四川、山东等地，其种子外观与正品瓜蒌种子相似难以区分，但其根部入药会引起患者呕吐、恶心等不良反应，因此准确区分瓜蒌种子及其混伪品对临床用药安全具有重要意义[20]。本研究通过DNA条形码技术和系统聚类树的结合，可将瓜蒌种子、湖北栝楼种子、王瓜种子准确区分开来，且该技术要求低、通用性高，同时又能够避免经验鉴别主观因素的影响，因此建议采用DNA条形码技术对中药材种子的真实性进行鉴定，确保中药材种源真实可靠，保障用药安全[8]。

常规的种子质量检测包括种子净度、千粒重、水分、生活力、发芽率、发芽指数、发芽势等指标，因本实验采用了砂质培养基未能对发芽指数和发芽势指标进行检测。该培养基可以在一定程度上减缓霉菌传播速度，降低发霉对种子发芽率的影响[18-19]，提高种子的发芽率。

千粒重反映种子贮藏物质的多少，种子成熟度和幼苗长势，对种子质量评价具有重要意义[21]；水分主要受人为及客观因素影响而非种子生物学特性决定，但水分的高低影响种子贮藏和寿命，应作为质量评价指标；生活力体现种子萌发潜力，并可以作为种子发芽水平的间接评价指标，尤其对于具有休眠特性的种子，通过测定生活力可以快速预知种子的价值[22]；发芽率可以较为直接的反映种子在田间的出苗状况，是评价种子质量最为重要的指标。因此，参考种子常规检测项目选择千粒重、水分、生活力、发芽率4项指标对瓜蒌种子质量进行评价。

本研究参考其他种子质量标准，统计不同产地和来源瓜蒌种子千粒重、水分、生活力，发芽率4项指标，结合均值置信区间和方差分析结果并以该方差水平下最小值所接近的整数为依据，提出瓜蒌种子质量标准：千粒重≥180 g，含水量≤7.0%，生活力≥85%，发芽率≥30%。该标准能有效排除不合格种子，保证用于生产的种子质量。

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