刘 超，汪 俊

1南昌大学研究生院医学部，南昌 330006 2江西省人民医院呼吸二部，南昌 330006

慢性气道炎症性疾病是以气道炎症、气道阻塞及气道重塑为主要特征的疾病。气道上皮是肺部的第一道屏障，其结构完整性的破坏或功能缺失是慢性气道炎症性疾病的启动环节，同时上皮细胞分泌大量的炎症介质，导致慢性炎症性疾病的发生发展。外泌体是一种新型纳米级别细胞间交流的载体，可将其内“货物”如蛋白质、mRNA、微小RNA(microRNA，miRNA)等活性物质转移到受体细胞中表达而发挥生物学作用，因此外泌体逐渐成为近些年的研究热点之一。有研究表明外泌体在慢性气道炎症性疾病的发生发展起着重要的调控作用，在炎症状态下，外泌体分泌增多，可促使炎症的级联放大效应，而且其作为疾病的诊断标志物和理想的药物载体有着巨大的前景。本文简要概述外泌体在支气管哮喘(简称哮喘)、慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)中的诊疗及作用。

外泌体的简介、形成机制及生物学功能

在人们最早认识外泌体时，将其视为细胞排出的一种“垃圾袋”，随着人们对外泌体这方面不断深入的研究，发现其是具有多种功能的新型细胞间通讯工具。外泌体是一种直径40～100 nm双脂质结构的纳米膜囊泡，能被多种细胞所分泌，如上皮细胞、树突状细胞、肿瘤细胞、淋巴细胞等[1]。不仅如此，外泌体在大多数体液如尿液、血液、脑脊液、腹水、支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)等中也能检测到[2-6]。截止2018年2月，通过外泌体数据库(http：∥www.exocarta.org/)，已经确定不同组织来源的外泌体其内活性物质包括41 860种蛋白质、3408种mRNA、2838种miRNA。外泌体膜表面含有共同检测的标志性蛋白，包括Alix、Tsg101、热休克蛋白(HSP70、HSP90)、4次跨膜蛋白家族成员(CD63、CD81)等，而不同组织来源的外泌体含有特异性蛋白，其与细胞的特异性功能相关，如来自结肠上皮细胞的外泌体含有特异性蛋白A33[7]，树突状细胞来源的外泌体可分泌具有抗原呈递功能的主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)Ⅰ和MHCⅡ类分子[8]。外泌体除了含有相关蛋白，其内的mRNA、miRNA以旁分泌或远距离传导的形式介导细胞间遗传信息的交流。外泌体被受体细胞摄取后，其内转移的miRNA可以调节受体细胞中的基因表达；肿瘤细胞来源的外泌体miRNA能促进肿瘤的增殖与转移、血管生成及抑制免疫系统[9]。

外泌体是晚期胞内体(即多泡体)向内萌芽而形成，通过多泡体可以与细胞质膜融合将其内的管腔囊泡释放到细胞间隙或循环中；内吞体分选转运复合体(endosomal sorting complex required for transport，ESCRT)是由4个复合物(ESCRT0、ESCRTⅠ、ESCRTⅡ、ESCRTⅢ)和相关蛋白(VPS4、VTA1、ALIX等)构成的多蛋白复合物，以泛素依赖的方式参与调控多泡体的生物发生和降解的机制，而溶血磷脂酸在外泌体的生物合成，尤其对管腔囊泡的形成具有关键的作用[10]。外泌体的产生及分泌则取决于不同的Rab-GTP酶和某些效应器的活性，它们能调节特定细胞器之间的囊泡运输，之后的研究将会增加对细胞特异性机制的了解，以此控制外泌体的分泌[11]。

外泌体是参与多种生理和病理过程的细胞间信号介质，其被受体细胞摄取的途径有3种：(1)外泌体表面的膜蛋白可以与靶细胞中的受体相互作用并激活细胞内信号转导；(2)外泌体表面的膜蛋白可以被细胞外基质的蛋白酶切割，而切割的片段可以充当与靶细胞结合的可溶性配体并激活细胞内的信号转导；(3)外泌体可以与靶细胞膜融合将其内的生物活性物质释放到受体细胞内，其内容物可激活靶细胞内的信号转导作用[12]。Escudier等[13]在临床Ⅰ期试验中发现，树突细胞来源的外泌体(dendritic cell-derived exosomes，DEX)可以用作抗肿瘤疫苗治疗转移性黑色素瘤患者。Morse等[14]也证实了DEX的抗肿瘤疫苗是可行的，将含DEX的疫苗注射给非小细胞肺癌患者，增加了T细胞和NK细胞的活性，明显使患者的病情得到改善。

外泌体在慢性气道炎症性疾病发生与发展中的作用

相关研究证实，外泌体的生物学作用在慢性气道炎症性疾病如哮喘、COPD中发挥重要作用，如细胞间信息传递、免疫调节、炎症反应及信号转导。

外泌体与支气管哮喘支气管哮喘是以气道高反应性、可逆性气流受限为特征的慢性气道炎症性疾病。Admyre等[15]首次发现人类BALF中外泌体的存在，从BALF中提取的外泌体也类似单核细胞可以表达MHCⅠ和MHCⅡ类分子、CD54、CD63及CD86；其能通过黏附、呈递抗原及表达共刺激信号分子而在T细胞中起免疫调节作用。Canas等[16]从哮喘患者和健康人群的外周血中提取嗜酸性粒细胞(eosinophils，EOS)的外泌体，通过流式等分析外泌体可以诱导哮喘患者EOS中活性氧和一氧化氮增加，破坏气道中的正常细胞和组织，并引起嗜酸性粒细胞迁移及黏附的增强。研究显示哮喘患者BALF中外泌体包含白三烯(leukotrienes，LT)合成酶，其可促进气道上皮细胞释放LT和细胞因子白介素-8(interleukin-8，IL-8)，故BALF中外泌体可能通过诱导IL-8和LT在肺中的生成有助于阐明哮喘的免疫炎症机制[6]。Fei等[17]发现哮喘患者EOS中的外泌体可以改变支气管平滑肌细胞及气道上皮细胞的正常功能，将支气管平滑肌细胞、气道上皮细胞与外泌体共培养或单独培养，发现细胞与外泌体共培养时，与哮喘相关的基因[如转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)、基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase，MMP-9)、核转录因子-κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)等]表达量上调。而TGF-β、VEGF和MMP-9主要参与哮喘的气道重构，当外泌体被细胞摄取后，这些炎症介质的表达量会明显升高，因此外泌体很可能影响哮喘的气道重构阶段，导致气道出现持续性的炎症及气道上皮的损伤。研究发现外泌体中的miRNA很可能通过靶向哮喘相关基因而参与过敏性哮喘的发病机制。Levanen等[18]通过微阵列分析检测哮喘患者BALF外泌体中miRNA与健康人群有显著差异，其中24种miRNA与受试者的第1秒用力呼气量1有高度关联(R2=0.74)，对于大多数改变的miRNA都下调，而许多下调的miRNA参与IL-13的调节，并导致丝裂原活化蛋白激酶、酪氨酸激酶-信号转导和转录激活子信号通路的改变。另一研究显示屋尘螨诱导的哮喘小鼠BALF中外泌体分泌的数量是正常对照组的8.9倍，其中外泌体中的54种miRNA在气道和肺组织中呈负相关，IL-13、IL-5Ra等31个基因在气道中靶向的miRNA上调，而在肺组织中是下调[19]。IL-13主要由Th2细胞分泌，而外泌体中的miRNA靶向IL-13基因并引起其上调，因此哮喘患者外泌体中miRNA可能会导致Th1/Th2细胞平衡失调，而Th2细胞的异常升高则导致机体免疫耐受功能受损，进一步加重哮喘的发病。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)的吸入能增加BALF中外泌体的释放，诱导混合性Th1和Th17细胞反应，导致IL-12p70和IL-6的释放增加而参与气道的过敏性反应[20]。Vargas等[21]发现在LPS的刺激下，中性粒细胞来源的外泌体可以增强气道平滑肌细胞的增殖，对于重度哮喘和激素抵抗性哮喘，外泌体可以促进疾病本身的发展及气道重塑的改变。TGF-β参与哮喘气道炎症及气道重塑的过程，抑制上皮细胞的增殖并诱导其凋亡和上皮间质转化。支气管成纤维细胞能分泌外泌体，其可被气道上皮细胞吸收，而TGF-β2在严重哮喘患者成纤维细胞中过表达，可诱导外泌体中TGF-β2上调，导致上皮细胞增殖的降低，而敲除TGF-β2基因则促进气道上皮细胞的增殖；因此在重度哮喘患者中，成纤维细胞来源的外泌体可参与调控体内TGF-β2信号通路，进而促进气道上皮细胞的增殖[22]。上述结果表明，不同细胞来源的外泌体可能通过多种途径参与哮喘的发生及发展。

外泌体与COPDCOPD是呼吸系统疾病中的常见病和多发病，患病率和病死率一直居高不下，是一种以持续性、不可逆性气流受限为特征的慢性气道炎症性疾病。Moon等[23]发现香烟烟雾提取物(cigarette smoke extract，CSE)刺激上皮细胞会增加BEAS-2B细胞中外泌体的蛋白浓度，并诱导Rab-27A基因的表达，而该基因的表达可以调节小鼠肺组织上皮细胞和BEAS-2B细胞中外泌体的分泌。CCN1是富含半胱氨酸的细胞外基质相关蛋白，参与细胞增殖、黏附、迁移、分化等多种病理过程[24]。CSE的持续暴露可以诱导外泌体中flCCN1的表达增加，此外，flCCN1通过介导IL-8的释放及中性粒细胞的募集参与肺气肿的炎症反应；CSE的持续暴露将外泌体中flCCN1切割成CCN和cCCN1，而cCCN1可以促进MMP-1的产生，MMP-1的表达上调会促进肺气肿的发生；以上研究表明，CSE诱导的肺上皮细胞分泌的外泌体增多是吸烟所致肺气肿的致病因素之一[23]。Yu等[25]发现在CSE的暴露下，HBE细胞中外泌体可促进肺成纤维细胞向肌成纤维细胞分化，并诱导支气管上皮细胞中外泌体miR-210的表达上调；miR-210通过直接靶向ATG7调节自噬过程，其表达水平与肺成纤维细胞中的ATG7的表达呈负相关，沉默ATG7是导致肌成纤维细胞分化的原因之一，因此，CSE可诱导支气管上皮细胞中外泌体介导COPD患者气道纤维化的发展。巨噬细胞来源的外泌体可通过转移的miR-223诱导单核细胞向巨噬细胞的分化，因此可调节COPD患者的免疫防御和炎症反应[26]。呼吸感染性疾病可导致机体细胞或体液中外泌体的释放增多，哮喘和COPD的共同特征之一是气道ATP水平的增高，而ATP水平的增高可引起外泌体通过P2X7/caspase-1信号机制释放IL-1β和IL-18，导致中性粒细胞的募集增多而加重COPD和哮喘的发生[27]。肺泡巨噬细胞来源的外泌体可调节肺部炎症性疾病的发病过程，其通过转运抑制信号因子SOCS-1和SOCS-3蛋白到肺泡上皮细胞，SOCS-1抑制γ-干扰素诱导的信号转导和转录激活子-1信号通路的活化，而SOCS-3抑制IL-6诱导的信号转导和转录激活子-3信号通路的活化[28]。有文献报道，内皮细胞来源的外泌体(endothelial microparticles，EMPs)在COPD患者循环中分泌增加，EMPs含有特异性的标记蛋白，主要包括CD144、CD31、CD146、CD62E，而EMPs释放的增加与COPD疾病进展阶段及肺气肿的肿胀程度相关[29]。因此，在外界有害刺激因素的影响下，外泌体的释放量会增加，其内的活性物质可引起炎性介质的释放增多和相关信号通路的转导，进一步促进COPD患者病情的发展及恶化。

外泌体在慢性气道炎症性疾病诊断及治疗中的应用

外泌体是一种新型的疾病诊断标志物和理想的药物载体，在肿瘤、神经系统疾病、心血管疾病及慢性气道炎症性疾病等疾病中均涉及。这些纳米囊泡之所以能作为疾病的诊断标志物和理想的药物载体，主要原因为：(1)外泌体能反映起始细胞的生理状态和微环境，且大多数细胞能分泌特异性的蛋白和核酸；(2)外泌体广泛存在于血液、尿液、脑脊液、BALF等体内多种体液循环中，其能向远处器官或细胞转移；(3)外泌体由于特殊的磷脂双分子层结构，保护其内容物免于酶的降解，从细胞释放后能稳定存在胞外环境中。

外泌体在哮喘中的应用循环中的miRNA可作为多种疾病的潜在生物标志物，而外泌体中的miRNA以无创、远距离传送、靶向特定的靶点等优势更适合作为疾病的诊断标志物。研究显示呼出气冷凝液中外泌体miRNA具有作为肺疾病诊断标志物的潜力，在哮喘患者呼出气冷凝液中11种miRNAs的表达水平明显高于健康人群[30]。有学者表明哮喘患者BALF外泌体中含有上皮细胞的标记性蛋白mucin1可作为潜在的诊断标志物[6]。目前重度哮喘的治疗仍以糖皮质激素为主，但由于其局限性及药物的不良反应，导致患者的治疗效果不理想。有研究显示，外泌体有可能为哮喘的治疗重燃希望，其依据主要有以下几点：(1)间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)的外泌体能发挥免疫抑制作用。Du等[31]发现MSCs的外泌体能促进调节性T细胞的增殖，通过上调哮喘患者中外周血单核细胞的抑制因子IL-10、TGF-β而发挥免疫抑制作用。(2)开发抗过敏疫苗。Almqvist等[32]将耐受性外泌体腹腔注射给哮喘小鼠后，其BALF中嗜酸性粒细胞浸润及血清中免疫球蛋白E水平明显降低，并提出以外泌体为载体的抗过敏疫苗、药物递送可能应用于临床上过敏性哮喘的靶向治疗。(3)减少外泌体的分泌量。有研究表明中性鞘磷脂酶抑制剂GW4869可以减少BALF中Th2细胞因子的表达及嗜酸性粒细胞数，从而有效缓解哮喘的气道炎症反应[19]。

外泌体在COPD中的应用临床上，COPD的诊断主要依赖于肺功能及影像学检查，但有文献报道外泌体不仅能作为COPD的诊断标志物，而且可以评估COPD患者病情的严重程度。研究显示EMPs可用于评估COPD患者的内皮损伤程度，CD31+EMPs在轻度COPD患者和肺气肿患者中表达水平升高，其能反映内皮细胞的凋亡，而CD62E+EMPs在重度COPD患者中表达水平升高，其能反映内皮细胞的活化[33]。Lacedonia等[34]研究显示COPD患者的痰液中EMPs的分泌量与FEV1呈负相关，而EMPs可能作为COPD的潜在标志物。血清中miR-21及miR-181a可评估由于重度吸烟导致的COPD患者发展严重程度的潜在标志物[35]。Akbas等[36]研究显示与健康人群相比，COPD患者血清中miR-20a、miR-28-3p、miR-34c-5p、miR-100下调，而miR-7上调，这些miRNA可能作为COPD的诊断标志物。Burke等[37]研究显示COPD患者血清中外泌体内的1种miRNA显著上调，而BALF中外泌体内的4种miRNA显著下调，这些外泌体中的miRNA可能作为COPD患者无创的诊断标志物。关于外泌体在COPD上治疗的文献报道较少，有学者提出以外泌体中的miR-210为靶点设计新药物将可能改善COPD患者气道纤维化的发展[25]。MSCs有促进组织再生、抗炎反应、免疫抑制等多种潜在作用，来源MSCs的外泌体能在急性肾损伤合并严重免疫缺陷疾病的小鼠中促进肾再生[38]。另有研究显示，MSCs释放的外泌体包含具有修复能力的miRNA或mRNA，MSCs来源的外泌体是通过表达角质细胞生成因子mRNA减缓急性肺损伤的相关症状，如肺水肿和肺部炎症的减轻[39]。因此推测外泌体在COPD的治疗方式可能有以下两种：(1)清除其内与COPD疾病进展相关的活性物质；(2)可作为一种免疫调节剂或具备使肺再生的能力。

综上，随着外泌体的研究日益增多，其在各疾病中的生物学作用渐渐浮出水面。而外泌体在慢性气道炎症性疾病中发挥促炎作用，以细胞旁分泌等途径参与介导细胞间通讯、细胞分化、信号转导、炎症因子释放等发病过程。但目前而言，外泌体在慢性气道炎症性疾病中信号通路的转导机制研究较少，而其在肿瘤、心血管疾病中的发病机制研究较多。外泌体及其miRNA或mRNA在哮喘、COPD等疾病的靶点受到广泛关注，且其在循环中稳定性高及靶向性强，因此外泌体作为理想的药物载体、抗过敏疫苗、免疫抑制剂等治疗方面有着巨大的优势，相关的研究成果将会逐步在临床中应用。但外泌体的研究目前尚处于初级阶段，关于外泌体的分离提纯、分泌的特殊机制、介导相应炎症通路的信号转导以及其作为气道慢性炎症性疾病的诊断标志物、理想的药物载体以达到精准的靶向治疗，需要长时间的科学探讨及科研人员的共同努力。