杜 宇，史应进，张艳辉，贾妮亚，范俊英，王彩丽*

（包头医学院第一附属医院，内蒙古 包头 014010）

足细胞是维持肾小球基底膜（GBM）结构和功能正常的主要细胞之一。而TRPC6、α-actinin-4又是维持足细胞正常结构和功能的主要蛋白，因为足细胞不可再生的特性，它的损伤导致并增加了蛋白尿的发生[1]，进一步加剧肾小球的硬化，。阿霉素有非常强烈的细胞毒性作用，可以直接对肾细胞产生损伤，其机制可能是从DNA水平干预了足突细胞蛋白的合成，从而破坏足突细胞的结构，改变了足突细胞形态[2]。因此目前被公认的能较好模拟人类肾小球疾病的动物模型就是阿霉素肾病大鼠模型，该模型的病理类型为微小病变（MCD）和局灶节段性肾小球硬化（FSGS）。本文通过分析TRPC6、α-actinin-4在大鼠正常肾组织和阿霉素肾病大鼠不同病理类型肾组织的表达差异，以探讨该分子在蛋白尿发生中的可能作用及相互关系。

1 材料余方法

1.1 材料

健康雄性SD大鼠30只，体重200 g左右（内蒙古大学动物中心提供，合格证号：SCX（蒙）2002-0001）。盐酸阿霉素（山西普德制药10 mg/支）。兔抗鼠α-actinin-4多克隆抗体：兔抗鼠TRPC6多克隆抗体（浓缩型）100 ug/mL MAB1682美国Chemicon公司。SP试剂盒（北京博奥森）。DAB显色系统（福州迈新）。

1.2 模型建立及分组

实验大鼠适应性喂养1周后随即分为3组：正常对照组（n=10）、微小病变组（MCD组，n=10）、局灶节段性肾小球硬化组（FSGS组，n=10）。MCD组测定24小时尿蛋白定量、血清白蛋白、总胆固醇、肌酐，在非麻醉状态下尾静脉一次性注射盐酸阿霉素7.5 mg/kg，并于注射后第7天和第14天分别测定24小时尿蛋白定量、血清白蛋白、总胆固醇、肌酐，第14天处死对大鼠的肾组织制备成蜡块备用。FSGS组大鼠测定24小时尿蛋白定量、血清白蛋白、总胆固醇、肌酐，在非麻醉状态下第7天尾静脉注射阿霉素5 mg/kg，第14天尾静脉注射阿霉素2.5 mg/kg，注射后28天和56天分别测定24小时尿蛋白定量、血清白蛋白、总胆固醇、肌酐，第56天处死对大鼠的肾组织制备成蜡块备用。

1.3 免疫组化

石蜡切片脱蜡水化，采用SP法免疫组化试剂盒，检测TRPC6、α-actinin-4。

1.4 影响采集

用Olympus DP72摄象头及DP-BSW采集图像，利用Image Pro Plus 6.0（IPP6.0）图像分析软件，分别测定每个肾小球中TRPC6、α-actinin-4阳性面积占其整个肾小球面积的比。

1.5 统计学方法

采用SPSS 17.0统计学软件进行数据分析，多组间的比较采用单因素方差分析，计量资料以“±s”表示。

2 结 果

2.1 TRPC6

TRPC6在微小病变表达水平较对照组显著增多（P＜0.01），在局灶节段性肾小球硬化肾小球内的的表达水平较对照组显著增多（P＜0.01），TRPC6在局灶节段性肾小球硬化组中增多较微小病变组更加显著（P＜0.01）。

表1 TRPC6在不同病理类型大鼠肾小球的表达对比（n，%）

2.2 α-actinin-4

α-actinin-4在微小病变组表达增加（P＜0.01），而在局灶节段性肾小球硬化组表达与对照组无明显差异。见表2。

表2 α-actinin-4在不同病理类型大鼠肾小球的表达对比（n，%）

2.3 TRPC6，α-actinin-4的表达

对照组TRPC6，α-actinin-4两者的表达无差异（P＞0.05），而肾小球内者的表达呈负相关（R=-0.633，P＜0.01），随着TRPC6的表达增加，α-actinin-4的表达减弱。见表3、图1。

表3 TRPC6、α-actinin-4的表达相关性

图1 TRPC6与α-actinin-4表达相关趋势图

3 讨 论

足细胞是一种增殖能力及其有限的终末分化细胞，具有稳定的表型[3]，它是维持GBM结构和功能正常的主要细胞之一。因为足细胞不可再生的特性，它的损伤导致并增加了蛋白尿的发生[4]，进一步加剧肾小球的硬化[5-6]。

足细胞正常功能及结构需要几个主要蛋白的相互作用[7]，而当足细胞受损时，足细胞的足突间裂孔隔膜（SD）功能和结构会发生改变，这些主要结构蛋白的改变引起了其结构以及功能失调，从而造成肾小球足细胞的功能和结构的改变，蛋白从改变的足细胞中漏出引起了蛋白尿。进一步的研究显示[8-9]，TRPC6编码的蛋白与足细胞的骨架蛋白actin（肌动蛋白）有着非常紧密的联系。在体外培养成熟的足细胞，当其发生TRPC6蛋白的过度表达，actin纤维就会发生大量的解聚，从而使裂孔隔膜结构发生改变。TRPC6基因突变可使足细胞内钙离子增加从而引起增殖减少、细胞凋亡进而减少足细胞的数量。

目前关于TRPC6，α-actinin-4的相关性研究还很少，国外未见相关报道，国内仅孙希峰[10]等做过两者的相关性研究。本研究显示，在对照组TRPC6，α-actinin-4两者的表达无差异（P＞0.05），而发生病变的肾小球内两者的表达呈负相关（R=-0.633，P＜0.01）随着TRPC6的表达增加α-actinin-4的表达减弱，与孙希峰等人的研究结果相似，这可能与TRPC6高表达通过使细胞内钙离子浓度升高、直接影响肌动蛋白支架以及组成机械敏感性钙离子通道引起足细胞的损伤和脱落，致使足细胞数量减少，而α-actinin-4做为足细胞的骨架蛋白从而表达数量减少以及TRPC6蛋白过度表达时，actin纤维大量解聚，裂孔隔膜结构松散而导致α-actinin-4表达下降。

TRPC6与α-actinin-4作为重要的构成足细胞蛋白分子其作用机制目前仍未背完全阐明，而探讨不同病理类型两者的表达差异进一步探讨TRPC6和α-actinin-4的相关性，以及其在足细胞损伤中的作用，希望给临床诊断、治疗效果及预后的判断提供有价值、无创的工具。期望早期对TRPC6、α-actinin-4的活性进行干预来减少对蛋白尿患者足细胞的损伤，延缓肾衰竭的进展。

[1] 王建中,陈香美,师锁柱，等.基质金属蛋白酶-9和金属蛋白酶组织抑制物-1在IgA肾病肾组织中的表达[J].中华内科杂志,2002,41(2):75-78.

[2] 张丽芬,黄文政,朱小棣,等.阿霉素肾病肾小球硬化动物模型的研究[J].中国中西医结合肾病杂志,2005,6(4):195-199.

[3] Li LS, Liu ZH. Epidemiologic data of renal diseases from a single unit in china: analysis based on 13519 renal biopsies[J]. Kidney Int,2004,66(3):920-923.

[4] Miller WG, Bruns DE, Hortin GL, et a1. Current issues in measurement and reporting of urinary albumin excretion[J]. Clin Chem,2009,55(1):24-38.

[5] Liu G, Kaw B, Kurfis J, et al. Neph1 and nephrin interaction in the slit diaphragm is an important determinant of glomerular permeability[J]. J Clin Invest,2003,112(2):209-221.

[6] Jafar TH, Stark PC, Schmid CH, et al. Proteinuria as a modi fi able risk factor for the progression of non-diabetic renal diseases.Kidney Int,2001,60(3):1131-1140.

[7] P Gerke, L Scllin, O Kretz, et a1. NEPH2 is located at the glomerular slit diaphragm, interacts with nephrin and is cleaved from podocytes by metalloproteinases[J]. Am Soc Nephrol,2005,16:1693-1702.

[8] CC Moiler, C Wei, MM Altintas, et al. Induction of TRPC6 channel in acquired forms of proteinuric kidney disease[J]. Journal of the American Society of Nephrology,2007,18(1):29-36.

[9] Shih NY, Li J, Karpit skii V, et al. Congenital nephrotic syndrom in mice lacking CD2-associated protein. Science,1999,286:312-315.

[10] 孙希峰,张 春,方 展,等.TRPC6高表达对小鼠足细胞裂孔隔膜分子和细胞骨架的影响[J].中华肾脏病杂志,2009,25(7):519-521.