许瑛瑛 胡福良 陈大福 郑火青

（1 浙江大学动物科学学院，杭州 310058；2 福建农林大学蜂学院，福州 350002）

蜜蜂是一类重要的经济昆虫，通过生产蜂产品和为农作物授粉带来巨大经济效益。蜜蜂孢子虫病是由微孢子虫寄生成年蜂中肠等组织引起的慢性传染性疾病，病原体包括蜜蜂微孢子虫(Nosema apis)和东方蜜蜂微孢子虫(Nosema cerenae)。自从2006年和2007年西班牙和中国台湾报道N. ceranae寄生西方蜜蜂[1,2]以来，关于蜜蜂孢子虫病的研究出现了井喷式增长。微孢子虫孢子能够通过蜜蜂排泄物、受污染的蜂机具以及蜜蜂交哺行为等途径在蜂群中轻易传播，因而蜂群感染率和个体感染率都很高。蜜蜂孢子虫病造成蜜蜂寿命缩短、蜂群生产力降低，给养蜂业带来巨大经济损失，是近年来影响世界养蜂业的主要病害之一。蜜蜂孢子虫病的检测与防治是蜜蜂病害防控的一项重要内容。

1 蜜蜂孢子虫病的检测

1.1 取样方法

蜂群感染微孢子虫的程度一般是用抽取样本中每只蜜蜂感染的平均孢子数描述[3]。蜂群中采集蜂受微孢子虫感染的比例最高[4-7]，其体内孢子数量也是最多的[8]，因此可以从巢门口抓取采集蜂作为样本检查孢子数。为了获得更为精确的数据，在不对蜂群生存造成不利的情况下至少一个月采集一次样本[9]， 此外，还应当统计蜂群中感染了微孢子虫的蜜蜂所占的比例[4, 6]。

一般而言，样本量越多，检测的结果越为精确。蜜蜂孢子虫病的诊断中，不同研究者抽取进行孢子计数的样本数并不统一，每群蜜蜂取样采集蜂20只到40只不等[10-12]。生物统计学中当样本数大于或等于30只记为大样本抽样，因此进行蜜蜂孢子虫病检测时抽取样本30只以上即可。

由于微孢子虫特殊的孢壁结构，在显微镜下能反射较亮的光，因此可以在显微镜视野内观察到椭球形的明亮孢子。按照每只蜜蜂样本加入1 ml水的比例，将获取的蜜蜂样本（或取腹部）先用1/3的水充分捣碎，再加入剩余的水混合均匀，取微量置于血球计数板上，用光学显微镜即可看到感染情况[13]。

1.2 光学显微镜检测

最早也是最简易的蜜蜂孢子检测方法是镜检法：将蜜蜂的中肠从腹部拉出，加入适量超纯水研磨之后，取微量于载玻片上，用显微镜观察并调节放大倍数即可观察到孢子。

在镜检法的基础上，使用针对孢子显色的染料能够降低镜检难度。例如，由天青和伊红组成的Giemsa染液，能够根据蛋白的酸碱性进行染色，将孢子染成深蓝色[14]；Luna 染液将孢子染成暗红色[15]；微孢子虫的孢壁外层是一层蛋白质，保护着内层的几丁质成分，使用Calcofluor染料对孢壁的几丁质染色后不易褪色，荧光相对稳定，且寄主组织碎片、细菌和病毒多角体不被染色，是一种非常可靠的染色剂[16,17]。

在关于微孢子虫的研究中，往往需要对孢子的活性情况进行区分。参考细胞凋亡双染的方法，人们将多种染料结合对孢子进行染色。由于死亡的孢子和具有活性的孢子的细胞核状态有所差别，因此可以使用核染料染色，如DAPI，或是对膜的透过性更好的Hoechest 33342、Sybr green Ⅰ和Sytox green等。同时结合使用荧光显微镜或透射电子显微镜，能够根据荧光颜色的不同进一步增加不同状态孢子的可识别度[18-20]。虽然镜检法操作简单，而且具有相当高的准确度，但这种方法对操作人员的经验要求较高；现阶段能够通过染色和流式细胞仪相结合对蜜蜂微孢子虫的孢子活性进行区分，减少镜检时人为因素造成的误差[21]，但这一方法费用较高。

1.3 分子生物学技术检测

微孢子虫的孢子壁较厚，由蛋白质和几丁质组成，提取其DNA难度较大。通常是先获取微孢子虫的孢原质后再提取其DNA，主要方法有利用碱性条件的刺激，使极丝弹出释放孢原质[22]；或者采用玻璃珠破碎法和液氮研磨法提取DNA。

目前为止，PCR扩增法因较高的灵敏度和准确性，被广泛应用于各种微孢子虫的种类鉴别[23]。这种方法操作较为简单，而且能够同时对大量样品进行检测，是目前蜜蜂孢子虫病病原种类鉴定最为常用的方法。为准确进行PCR扩增，引物的设计尤为重要，微孢子虫的16s rRNA基因是较好的选择对象之一，这段编码核糖体RNA的基因具有9个可变区和夹杂在其中的保守区，在生物进化过程中突变速度较慢，因此在大多数原核生物中，其序列都有所不同。

利用核酸扩增的原理，环介导等温扩增(Loopmediated isothermal amplification, LAMP) 法也可以对微孢子虫进行鉴定。该方法使用一种DNA置换酶（Bacillus stearothermophilus DNA polymerase，Bst DNA polymerase）以及4～6对特异性引物，能够在恒温条件下进行更高特异性的扩增，并具备反应速度更快等特点[24]。Ptaszynska等使用两对引物成功地对N.ceranae和N. apis进行了扩增[25]，证明了这种更加廉价和快速的检测方法在微孢子虫检测领域方面颇有前景。除检测孢子的有无外，被测样品受到感染的程度也经常是需要关注的因素，实时荧光定量PCR可对样品的孢子进行定量。

1.4 免疫学技术检测

除了使用PCR扩增的方法以外，免疫学方法也是较为常用的检测方法之一。Accoceberry等根据微孢子虫极丝蛋白和孢子表面蛋白的特异性，获得了E.bieneusi的单克隆抗体[26]。目前通过制备对微孢子虫特定蛋白具有抗性的抗体（SWP-32），进行酶联免疫反应（Methods Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA），能够更加精准且直观地观测到微孢子虫的存在[9]。刘锋（2009）制备了N. ceranae总蛋白的兔化抗体，通过ELISA检测技术，建立了蜜蜂微孢子虫的诊断方法，检测灵敏性可达到103个孢子/ml[27]。该技术灵敏度虽然较高，但易产生非特异性反应和交叉反应，干扰实验结果，在检测蜜蜂微孢子虫的实际应用中尚未成熟。

2 蜜蜂微孢子虫病的防治

因为微孢子虫具备原核生物的一些生理特征，所以最早被分类成原核生物。然而随着研究的进一步深入，人们发现微孢子虫更应该被归类为真菌。通过对微孢子虫的两种微管蛋白(α-tublin和β-tublin)基因进行系统进化分析发现，微孢子虫与接合菌门(Zygomycetes)的真菌亲缘关系较近[28,29]。其他一些针对RNA聚合酶亚基和蛋白质翻译过程中使用的延伸因子(protein translation elongation factor, EF)基因的分类学研究也支持这一论点[30]。针对微孢子虫，要想将其抑制甚至消灭而不损害其同为真核生物的宿主是十分困难的。兔脑炎微孢子虫（Encephalitozoon cuniculi）能够感染艾滋病患者，为了抑制这种孢子的繁殖，研究人员尝试使用了许多种药物，如阿苯达唑(Albendazole)、阿苯达唑亚砜(Albendazole Sulfoxide)、甲硝哒唑(Metronidazole)和环孢霉素(Cyclosporine)，结果发现，这些药物对治疗微孢子虫并无明显的作用，但是咪唑类药物能够一定程度控制孢子的侵染[31]。

对于N. ceranae，有研究表明，咪唑类药物甲硝哒唑和磺甲硝咪唑（Tinidazole）及烟曲霉素(Fumagillin)都能够有效抑制孢子的增殖[32]。咪唑类药物是我国严禁在养蜂生产中使用的药物，违法使用将承担法律责任。烟曲霉素是美国养蜂业中用来防治蜜蜂孢子虫病的主要药物[33]，它能够抑制真核生物细胞内的甲硫氨酸胺基肽酶2(methionine aminopeptidase2, MetAP2)的活性，这种酶能够水解蛋白质N端的蛋氨酸，是细胞内一种十分重要的蛋白降解和修复相关的酶[34]。Giacobino等在阿根廷中东部的研究表明，施用烟曲霉素降低了蜂群N. ceranae的感染水平，但与对照组相比，在蜂群群势上却没有改善作用[33]，所以关于烟曲霉素的效果仍有待系统评估。然而，烟曲霉素作为一种抗生素，在防治蜜蜂孢子虫病的同时，会对蜂产品造成污染，因而在欧洲很多国家和地区是被禁止使用的。我国相关法规并未涉及烟曲霉素的使用方法和残留限量，且目前我国市场还没有烟曲霉素的供应。

因此，我们要寻找相对温和、无污染且能够高效治疗蜜蜂孢子虫病的方法。已有研究的几种方法包括有机酸防治、基因水平防治、营养防治、天然化合物防治和微生物防治等。

2.1 有机酸防治

0.25 M的草酸糖浆溶液在实验室条件下能显著降低N. ceranae孢子数量，蜂群实验中，能显著降低蜜蜂感染率[35]，这种效果对预防蜂群微孢子虫感染极为显著，因此草酸可能是一种十分有效的蜂群孢子虫病的预防药物。养蜂生产中，有蜂农利用柠檬酸混合糖浆饲喂蜂群来防治蜜蜂孢子虫病，但目前尚无相关文献的数据支持。

2.2 基因水平防治

除了使用药物以外，单纯从抑制微孢子虫的繁殖而言，利用基因水平防治的效果也不错。Li等研究发现，受N. ceranae感染后，蜜蜂Wnt信号通路的抑制基因nake cuticle (nkd)表达上调，从而抑制蜜蜂的免疫，而采用RNAi的方法沉默蜜蜂的nkd基因表达后，蜜蜂的免疫功能上调且N. ceranae感染水平降低[36]。

2.3 营养水平防治

Basualdo等在蜂粮中加入了白蛋白和啤酒酵母，提高了蜂粮的营养成分，随后发现取食了这种饲料的蜜蜂，其血清中的蛋白含量明显提高，在感染N.ceranae后，存活率也有所提高[37]。这一研究说明，蜂群本身的营养水平有利于抵抗微孢子虫的感染，这也能解释为何在大流蜜期蜂群的患病程度相对较低。蜜蜂的免疫系统是对抗外来病原微生物最好的防御机制，因此对免疫系统的强化和刺激能够达到抵抗微孢子虫感染的预防效果。

2.4 天然化合物防治

蜜蜂服食由栎树皮提取物制成的“Nozevit”后，肠腔会覆盖一层密实的单宁，起到预防和治疗蜜蜂孢子虫病的作用。施药后，N. ceranae的孢子数量降低，蜂群封盖子数显著增加[38,39]。Maistrello等在糖块或糖浆中分别加入百里香酚（100 ppm）和白藜芦醇（10 ppm），饲喂给接种过N. ceranae孢子的蜜蜂，发现能够显著降低蜜蜂个体体内的孢子数并且显著延长蜜蜂存活时间[40,41]。1%浓度下的穿心莲水煎剂、葡萄皮醇提取物以及黄柏水煎剂都能够有效抑制孢子增殖，且7%穿心莲水煎剂能够显著提高感染N.ceranae的蜜蜂存活率，有助于蜜蜂肠道组织修复[42]。

2.5 微生物防治

肠道微生物是生物体内不可或缺的一种生物群体，它们能够协助宿主进行食物代谢，如对糖类的吸收、纤维素的降解和脂类化合物的储存和转化等[43-45]，也能通过刺激的方式提高宿主免疫系统的活性，抵抗病原生物的入侵[46]。再者，大部分肠道共生菌都有其独特的代谢产物，这些化合物除了能够协助宿主降解食物中的有害成分[47,48]、改变激素代谢水平[49]以外，可能还具有抗菌活性。从蜜蜂肠道中分离的芽孢杆菌属(Bacillus)和肠球菌属(Enterococcus)的细菌，经鉴定能够分泌细菌素(bacteriocin)，这些细菌素对宿主本身并没有显著的毒性，但使用它们处理N. ceranae后，发现其感染率明显下降[50]。乳酸菌（Lactobacillus）是蜜蜂肠道中十分常见的益生菌，饲喂约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)分泌的有机酸能够提高蜜蜂个体体内脂肪体的数量，提高烟曲霉素对微孢子虫的作用能力，增强蜂群的群势，同样作为益生菌的双歧杆菌（Biベdobacterium）也被发现能够降低N. ceranae对蜜蜂的侵染能力[51,52]。因此，微生物防治也是一种防治蜜蜂孢子虫病的重要途径。

另外，还有一些特殊的材料也能够抑制微孢子虫的侵染能力或繁殖能力，如Roussel等研究了10种海藻硫酸多糖的抗微孢子虫活性，发现分离自Porphyridium spp.的两种多糖对蜜蜂无毒，且其中一种能降低孢子感染水平和蜜蜂死亡率[53]。壳聚糖和肽聚糖能够显著减少孢子数量并改变抗菌肽基因的表达，刺激蜜蜂采集行为和延长受感染蜜蜂的寿命[54]。

但要注意的是，某些药物虽然能够相对有效地抑制微孢子虫的繁殖，但其用量也需要慎重控制，用量过高可能会造成对宿主的毒害作用，而用量过低则又可能造成病情的恶化。研究发现，烟曲霉素的作用与其用量有关，低剂量烟曲霉素的使用甚至会调节蜜蜂中肠的代谢水平，导致其内N. ceranae的增殖速度加快[55]。鼠李糖杆菌(Lactobacillus rhamnosus)分泌的益生素在浓度控制不当的条件下会导致蜜蜂体内酚氧化酶活性的降低，反而促使其体内N. ceranae数量显著增多(对照组的25倍)[56]。由此可见，虽然一些化合物和共生菌能够有效抑制微孢子虫的侵染和繁殖，但在利用它们进行预防和治疗时，需要慎重考虑使用量，否则会适得其反。

此外，加强蜂群的饲养管理也有利于预防蜜蜂孢子虫病。这些措施包括：选择地势高、阳光充足的场所，保持蜂箱内的干爽；减少开箱次数，防止对蜜蜂造成过多干扰；保证优质的饲料；到位的蜂场清洁工作。

3 结语

（1） 目前蜜蜂孢子虫病的检测技术日趋成熟，通过简单的镜检法即可判断蜂群患病与否，结合分子生物学技术，可以同时对大量样品进行检测，简单且快速；对样品的孢子进行定量，可以获得蜜蜂体内或蜂产品感染的程度，方便进一步制定适宜的防治方案。免疫学的检测由于容易产生非特异性反应，还需进一步改进。

（2） 由于蜜蜂生产蜂产品的特性，养蜂生产上用药受到严格的限制。烟曲霉素是在美国和加拿大等少数国家被允许用于防治蜜蜂孢子虫病的合法药物，但在抑制N. ceranae孢子增殖的同时对蜜蜂健康造成伤害，我国市场也没有烟曲霉素的供应，因此寻找绿色、高效的防治方法是我们关注的重点。近年来，在实验室条件下的研究中找到了多种适宜的方法，能够有效抑制N. ceranae孢子的增殖，但蜂群实验却涉及甚少，亟需进一步研究。而诸如醋酸、柠檬酸等生产上常用的防治物质仍需要进一步的实验验证。

（3） 由于缺乏适宜的体外培养条件和蜜蜂细胞系，许多防治孢子虫病的实验机制仍未清楚，且微孢子虫不能脱离蜜蜂个体，即使选择健康蜂群用于实验，也很难避免蜜蜂隐性携带其他病原带来的误差。因此，探究微孢子虫体外生长且成功增殖的培养体系也是今后研究的重要工作之一。

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