李 培， 林东昉

肠球菌系革兰阳性球菌，广泛存在于人和动物的消化道及女性生殖道中，是重要的条件致病菌，多见于医院感染。由于细菌固有耐药和获得性耐药的双重特性，以及各类抗生素广泛应用于临床造成的高选择性压力，导致多重耐药（multiple drug resistance，MDR）肠球菌增多，甚至出现耐万古霉素肠球菌（vancomycin-resistant enterococci，VRE）。2000年利奈唑胺上市，是首个应用于临床的唑烷酮类抗菌药物，用于治疗MDR革兰阳性菌感染，尤其是治疗VRE和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）。近年来，利奈唑胺耐药肠球菌的数量呈逐年增多趋势，同时新耐药机制的发现也使此药在临床上的使用遇到了挑战。

1 肠球菌的耐药性

肠球菌细胞壁坚厚，对很多抗生素呈固有耐药。例如通过产生低亲和力的青霉素结合蛋白（PBP）[1]。由于细胞壁的作用导致药物渗透障碍和产生氨基糖苷类抗生素低水平耐药。此外，肠球菌可以通过靶位改变、产生各种酶类（如钝化酶、水解酶等）、获得可转移的耐药基因、主动外排等机制对各类抗生素如β内酰胺类、糖肽类、氨基糖苷类（高水平）、氟喹诺酮类、大环内酯类、磷霉素类等耐药。在对VRE的研究过程中，现已发现vanA、vanB、vanC、vanD、vanE、vanG、vanL、vanM、vanN等耐药基因亚型，此类基因通过影响细胞壁对糖肽类抗生素的亲和力而介导耐药。肠球菌对新型抗菌药物利奈唑胺的耐药机制如23S rRNA突变、cfr基因等将于下文进行描述。

2 中国肠球菌耐药性变迁

耐药菌株的出现与抗生素的使用紧密相关，对肠球菌耐药率的统计和研究能更全面地指导临床用药。

2005－2016年中国CHINET细菌耐药性监测结果显示，国内革兰阳性菌株中肠球菌分离率在30%上下波动，2016年为29.3%[2-13]。其中最主要的两种肠球菌，粪肠球菌和屎肠球菌对庆大霉素、氯霉素、磷霉素等耐药率有下降趋势，粪肠球菌对上述抗生素耐药率分别从61.4%、43.5%、15.7%下降至33.0%、23.4%、3.0%，屎肠球菌则分别从81.9%、8.5%、31.2%下降至48.0%、5.8%、19.9%。对左氧氟沙星的耐药率比较稳定，两种菌分别在25%和85%左右。对红霉素、利福平等的耐药率居高不下，均在50%以上。对万古霉素、替考拉宁、利奈唑胺等耐药率目前处于低水平，均低于4%。备受关注的VRE，11年来，其耐药率目前也仅为0.4%（粪肠球菌）和1.9%（屎肠球菌）。参考上述数据，虽然肠球菌对利奈唑胺耐药率绝对值不是很高，但在最新2016年监测报告中粪肠球菌对利奈唑胺耐药率已有1.2%；屎肠球菌为0.2%。这些近年出现的利奈唑胺耐药菌株不容忽视，了解利奈唑胺的作用机制更有助于解决目前临床应用所遇到的问题。

3 利奈唑胺的作用机制与抗菌活性

利奈唑胺是一种细菌蛋白质合成抑制剂。它是通过结合核糖体肽基转移酶活性中心（peptidyl transferase center，PTC）的A位点发挥作用。A位点位于核糖体催化功能核心23S rRNA的V区[14]。利奈唑胺与50S核糖体亚基的结合，使3'末端氨基酰-tRNA（fMet-tRNA）受到干扰而无法进行肽酰转移，抑制蛋白质合成的初始阶段，但不影响翻译起始tRNA的形成、延伸与终止阶段[15]，这与以往抗菌药物抑制蛋白合成的作用方式不同。独特的作用特点使利奈唑胺与其他抗菌药物不容易发生交叉耐药，在体外也不容易诱导细菌产生耐药。

利奈唑胺对MRSA和VRE等革兰阳性菌，在体外和体内均具有抑菌活性[16]，对肺炎链球菌等链球菌属具有杀菌作用，对革兰阴性菌几乎没有抗菌活性，但对厌氧菌有一定活性[17]。在健康人体内，利奈唑胺口服后平均绝对生物利用度可达100%。稳态分布容积与人体含水总量相当，渗透性强，半衰期长，其代谢产物主要通过尿液排泄[18]。良好的药动学、药效学特性也使利奈唑胺在临床上用于革兰阳性菌感染治疗颇有优势。

4 肠球菌耐利奈唑胺的耐药机制

根据2017年美国临床和实验室标准化协会指南（CLSI），当利奈唑胺对肠球菌MIC≥8 mg/L时，定义为耐药；4 mg/L，为中介；≤2 mg/L，为敏感。根据已知的耐药机制，可以分为两大类。

4.1 非转移性耐药

4.1.1 23S rRNA V区突变 此突变是目前已知最主要的耐药机制，且粪肠球菌比屎肠球菌更容易被诱导突变[19]。突变方式为点突变，最常见的突变位置为G2576U[20]。有研究表明，经过诱导后V区2576位核苷酸发生突变，粪肠球菌和屎肠球菌的MIC在此位点突变后均有不同程度的升高，分别上升至8～128 mg/L和8～64 mg/L[21]，与突变23S rRNA拷贝数呈正相关。另外在耐药肠球菌株中还发现有C2192T、C2461T、U2500C、A2503G、G2505A等位点的突变。

4.1.2 核糖体蛋白L3、L4或L22突变rplC、rplD、rplV基因分别编码核糖体蛋白L3、L4、L22。在金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌等革兰阳性菌株中发现这些核糖体蛋白的突变可导致对利奈唑胺由敏感变为耐药[22]。在肠球菌中此突变所致的利奈唑胺耐药很少见，但最近有研究发现1株耐利奈唑胺屎肠球菌中存在核糖体蛋白L4上Asn130Lys的突变，同时此株菌也含有另外一个利奈唑胺耐药基因optrA[23]，是否L4突变可影响肠球菌的耐药性值得进一步探究。

4.2 转移性耐药

此类耐药通过外源性质粒介导。

4.2.1 氯霉素-氟甲砜霉素耐药（cfr）基因

4.2.1.1cfr基因[24]cfr基因属于S-腺苷甲硫氨酸（SAM）酶蛋白质超家族，在自然界中广泛存在，是多重耐药基因。它通过编码cfr甲基转移酶，催化细菌核糖体23S rRNA肽酰转移酶区域A2503位C8甲基化[25]产生耐药。该基因可导致细菌对氯霉素类、林可酰胺类、唑烷酮类等抗菌药物耐药。介导氯霉素类和林可酰胺类抗生素耐药机制中还伴有核苷酸C2498位甲基化的抑制作用。目前携带该耐药基因的质粒多见于动物葡萄球菌、肠球菌分离株[26]。

4.2.1.2cfr(B)分型 2015年美国首次报道了从临床屎肠球菌分离株中发现的新cfr基因型——cfr(B)基因，和先前已知的葡萄球菌和非屎肠球菌类肠球菌cfr编码的氨基酸序列相比较，它们的同源性仅有74.9%。该基因是通过整合在转座子Tn6218上在屎肠球菌以及艰难梭菌间传播，有可能造成大范围的传播[27]。但是关于含有此基因亚型肠球菌属的耐药水平需进一步确认。

4.2.2optrA基因 2015年报道了新的可导致对利奈唑胺耐药的基因——optrA基因，该基因具有可转移性，可通过质粒传播[28]。optrA基因编码ABC家族F亚家族蛋白。ABC超家族可分为3类，前两类外向转运子及内向转运子参与转运，第三类则现mRNA的翻译和DNA的修复有关[29]。经典的ABC超家族主要由跨膜区（transmembrane domain，TMD）和ATP结合域（nucleotide-binding domain，NBD）组成。而ABC-F家族组成缺乏跨膜区，仅有ATP结合域。以往关于该家族导致耐药的机制有两种假说，一是经典外排效应，通过ATP水解释放能量，细胞内药物通过跨膜区被转运出去。二是核糖体保护机制，通过竞争性地抑制药物与核糖体结合，从而降低胞内的药物浓度。2016年有研究通过对该家族基因vga(A)、lsa(A)进行转录翻译实验及核糖体药物结合实验，发现该家族导致耐药的机制更倾向于后者[30]。此外近些年又不断发现了一些optrA基因变异型，其中EYDD型（发生三处氨基酸改变：Lys3Glu、Asn12Tyr、Tyr176Asp）可使金黄色葡萄球菌和粪肠球菌的利奈唑胺MIC升高2～8倍[31]。但利奈唑胺MIC中介及敏感菌株中也存在此基因，其耐药性的发生可能和其他机制有协同作用，或者有某种机制导致该基因低表达等，具体机制如何有待深入研究。

在研究耐药机制的同时，有实验通过比较利奈唑胺敏感与耐药/中介肠球菌，发现耐药者具有更厚的生物膜。而且通过透射电子显微镜观察，利奈唑胺耐药或中介的肠球菌细胞壁往往比敏感者更厚[32]。生物膜是否参与耐药形成有待进一步探究。

肠球菌是重要的条件致病菌，耐药机制复杂。近些年来，利奈唑胺作为有效的抗菌药物在临床得到广泛使用，因为耐药菌株不断增多以及新型耐药菌株的出现，使得临床对肠球菌感染的预防与治疗变得更加棘手。对利奈唑胺等新型药物耐药的临床分离株过快出现，也提示需要严格控制使用此类药物。此外，新耐药机制的发现也使得未来利奈唑胺应用于临床治疗革兰阳性球菌感染受到挑战，且不排除其他新的耐药机制存在。在加强细菌耐药监测的同时也应开展相关耐药新机制的研究。

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