骆 新， 王 忠， 朱虎虎， 孙建新， 李琳琳

(新疆医科大学1基础医学院药理学教研室， 2医学实验动物中心， 乌鲁木齐 830011)

桑葚(mulberry)是桑科桑属多年生木本植物桑树的果实，椭圆形，长1～3 cm，表面不平滑。未成熟时为绿色，逐渐成长变为白色、红色，成熟后为紫红色或紫黑色，味酸甜。其营养丰富，含有多种功能性成分，如芦丁、花青素、白黎芦醇、维生素及Fe、Ca等矿物元素，并含有桑葚红色素、多糖和黄酮类物质。桑葚有补肝益肾、滋阴养血、黑发明目、祛斑延年的功效，已经被人们认为是一类具有营养保健功能的天然食品[1]。

现代医学研究表明，桑葚具有具有良好的防癌、抗衰老、抗溃疡、抗病毒等作用。针对桑葚开展的一些药理学实验结果也表明，桑葚能升高外周白细胞，有防止环磷酰胺所致的白细胞减少、中度促进淋巴细胞转化的作用，能使衰老的T细胞得到恢复、可促进血细胞的生长，并对粒单系祖细胞的生长有促进作用，在胃中能补充胃液的缺乏，可增强胃的消化力，进入肠内能刺激肠黏膜，使肠液分泌增多，肠的蠕动增强，降低细胞膜上Na+-K+-ATP酶活性。另有研究表明，桑葚具有抗氧化和降糖作用[2-3]，其主要活性成分为桑葚多糖(Mulberries polysaccharide,MP)。国内外学者对桑葚的实验研究多是在活性成分提取和理化性质的测定方面，桑葚多糖免疫调节作用的相关实验研究较少。

本课题在优化桑葚多糖提取工艺的基础上，观察多糖提取物对环磷酰胺诱导的免疫功能低下小鼠模型[4-6]的免疫调节作用，为其进一步开发和利用提供理论依据和参考。

1 材料与方法

1.1实验动物与分组清洁级昆明种小鼠140只，雄性，体质量18～22 g，由新疆医科大学医学动物实验中心提供，动物使用许可证号：SYXK(新)2016-0002，动物生产许可证号：SCXK(新)2016-0001。根据实验观察目的，分2次领取，每次领取70只，分别用于脏器指数、细胞免疫功能和体液免疫功能的测定。实验小鼠按体质量均衡随机分为5组，每组14只，分别为正常对照组、模型对照组、MP低、中、高剂量组(0.25、0.5、1 g/kg体质量，根据提取率计算，相当于生药量3.8、7.6、15.2 g/kg体质量)。实验在新疆医科大学医学动物中心屏障实验室进行，并按实验动物使用的3R原则给予人道的关怀。

1.2药品与试剂桑葚干(mulberry) 购于新疆吐鲁番地区，RPMI1640细胞培养液、小牛血清、绵羊红细胞悬液、Hanks液(美国Hyclone公司)，环磷酰胺(江苏恒瑞医药股份有限公司)，刀豆蛋白A(ConA)、四甲基偶氮唑蓝(美国Sigma公司)，丙酮、二甲基亚砜、苯酚、乙醚(天津永晟精细化工分析纯试剂)，95%乙醇、无水乙醇、浓硫酸(济南世纪通达化工分析纯试剂)。

1.3仪器VS-1300L-U型超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司),UV-2501PC 双光束紫外分光光度计(日本岛津公司),HF212UV CO2培养箱(上海斯高勒生物科技有限公司),SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵江苏宏凯仪器厂,MC318 酶标仪(上海将来实验设备有限公司),MoticAE31 倒置相差显微镜(北京瑞科中仪科技有限公司)。

1.4MP的制备和含量测定[6]将桑葚干粉碎后，准确称取桑葚粉10 g加500 mL的蒸馏水回流提取2次，每次3 h，浓缩至膏状。再经乙醇沉淀、离心、去蛋白、二次醇沉后干燥，总糖的测定采用苯酚-硫酸法，还原糖采用3,5-二硝基水杨酸法测定，二者差值为多糖含量。计算得出该条件下桑葚多糖的提取率为5.28%。

1.5小鼠免疫功能低下模型制备及指标测定[7-8]2次领取的小鼠除正常对照组、模型对照组给予纯净水外，余各组小鼠按设定剂量灌胃给药，连续灌胃给药4 w。首次领取的小鼠灌胃至25 d，正常对照组小鼠按0.1 mL/10 g体质量给予生理盐水，余各组小鼠按80 mg/kg体质量腹腔注射给予环磷酰胺诱导小鼠免疫低下模型，连续注射3 d。实验第28天，各组小鼠称重后，采用颈椎脱臼法处死小鼠，沿腹中线打开腹腔和胸腔，游离脾脏、胸腺，滤纸处理后称重，按每10克体质量脏器的重量(mg)计算脾脏、胸腺指数反应免疫功能的强弱；将脾脏置于盛有适量无菌Hank′s液平皿中，轻轻磨碎脾脏，制成单个细胞悬液。经200 目筛网过滤，用Hank′s液洗2遍，1 000 r/min离心10 min。采用ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化试验测定脾脏淋巴细胞转化功能。用酶标仪以570 nm波长测定光密度(OD)值。

第2次领取的小鼠灌胃至23 d，正常对照组小鼠按0.1 mL/10 g体质量给予生理盐水，余各组小鼠按80 mg/kg体质量腹腔注射环磷酰胺，连续注射3 d，各组小鼠按0.2 mL/只腹腔注射体积分数为2%的绵羊红细胞悬液进行免疫。末次灌胃后2 h，摘除眼球取血于离心管内，3 000 r/min离心15 min后取上清，用生理盐水将血清倍比稀释，将不同稀释度的血清分别置于微量血凝实验板内，每孔100 μL，再加入100 μL 0.5%(v/v)SRBC悬液，混匀，装入湿润的平盘内并加盖，于37℃温箱孵育3 h，观察血球凝集程度，并计算血清溶血素HC50；打开腹腔游离脾脏，放在盛有Hank′s液的小平皿内，轻轻磨碎脾脏，制成细胞悬液，经200目筛网过滤，用Hank′s液洗2遍，1 000 /min离心10 min，最后将细胞悬浮在5 mL RPMI1640培养液中，计数细胞，并将细胞浓度调整为5×106个/mL，用以抗体生成细胞检测。

2 结果

2.1脾脏、胸腺指数测定与空白对照组小鼠比较，模型对照组小鼠胸腺指数降低，差异有统计学意义(P<0.05)，脾脏指数降低，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型对照组比较，MP中、高剂量组脾脏指数升高，差异有统计学意义(P<0.05)；MP高剂量组胸腺指数升高，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 脾脏、胸腺指数测定

注：与空白对照组比较，#P<0.05； 与模型对照组比较，*P<0.05。

2.2MP对小鼠脾脏淋巴细胞转化功能的影响与正常对照组比较，模型对照组细胞OD值明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型对照组比较，MP中剂量组细胞OD值升高，差异有统计学意义(P<0.05)，MP高剂量组细胞OD值明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 MP对小鼠脾脏淋巴细胞转化功能的影响

注：与空白对照组比较，#P<0.05； 与模型对照组比较，*P<0.05。

2.3MP对小鼠抗体生成细胞功能及血清溶血素水平的影响与空白对照组比较，模型对照组抗体OD值与血清HC50水平均明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型对照组比较，MP多糖中、高剂量组抗体OD值升高，差异有统计学意义(P<0.05)；MP多糖高剂量组血清HC50显著增高，差异有统计学意义(P<0.05)，见表3。

表3 MP对小鼠抗体生成细胞功能及血清溶血素水平的影响

注：与空白对照组比较，#P<0.05； 与模型组比较，*P<0.05。

3 讨论

桑葚为典型的药食兼用植物代表之一，在新疆尤其南疆地区的桑葚品种较多且种植面积较广，是一类含有丰富的人体必需的多种功能成分，具有很高的营养价值。新疆虽桑椹资源丰富，但产品种类多为初级加工，多见于饮料、果汁、果酱等产品的生产和销售，其深加工还没有得到充分的开发利用[9]。以桑葚作为开发功能性食品及药品的优质原料，意义重大，不仅能满足市场对桑葚保健食品的需求促进经济转型，还能改善身体素质、增进健康、提高生活质量。本课题组前期实验结果也表明MP具有一定的抗疲劳作用[10]。

多糖广泛存在于动物细胞膜和植物、微生物的细胞壁中，不仅是生命有机体的重要组成成分，还具有广泛的生物活性，如免疫调节作用等[11]。植物来源的多糖是由许多相同或不同的单糖以α-或β-糖苷键所组成的化合物，普遍存在于自然界植物体中，桑葚就是其中之一。本实验采用环磷酰胺诱导制备免疫功能低下小鼠模型,观察MP多糖免疫调剂作用。结果显示，MP可在升高胸腺、脾脏指数的同时可有效促进小鼠脾淋巴细胞的转化功能，有效地提高抗体生成细胞功能及血清溶血素水平，可初步判定MP对免疫低下模型小鼠具有增强小鼠细胞免疫和体液免疫功能的作用。

多糖可以通过多条途径、多个层面对免疫系统发挥调节作用，相关免疫实验证明，多糖通过激活巨噬细胞、网状内皮系统、T和B淋巴细胞、补体和促进干扰素、白细胞介素生成来完成调节免疫系统和改善机体的免疫功能[12-14]。但多糖在天然植物中的含量低且不易分离，更重要的是多糖的药理作用与诸多因素有关，尤其是根据多糖的结构表征特点还无法确定本实验结果发挥作用的具体是哪种多糖组分，这也为MP调节免疫的机制研究增加了复杂性。课题组将分离、纯化MP组分，进一步开展MP免疫调节作用机制的研究。

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