姜 歆, 邓 玮

(1重庆市人民医院病理科， 重庆 400013; 2重庆市第五人民医院病理科， 重庆 400062)

宫颈上皮内瘤变(CIN)是宫颈癌(SCC)发生发展重要的癌前病变，SCC的发生要经过从低级别鳞状上皮内瘤变( LSIL，对应组织学诊断为CINⅠ)到高级别鳞状上皮内瘤变(HSIL，对应组织学诊断为CINⅡ-Ⅲ)再到浸润癌的一系列的前驱改变[1]。因此常规进行SCC筛查，及早发现CIN并合理治疗，是防治SCC的关键。但目前通常使用的以细胞学和高危型人乳头瘤病毒(HR-HPV)检测为基础的筛查方案存在着特异性低、准确性不高的问题，并且细胞学筛查中诊断为不能明确意义的非典型鳞状细胞(ASCUS)及LSIL的病例中经组织学证实存在一定比例的CINⅡ-Ⅲ级病变。因此急需一种特异性更高的方法来提高诊断的准确性，避免过度治疗。本研究通过对HR-HPV阳性、细胞学诊断为ASC-US和LSIL患者的宫颈细胞学标本进行HPV-L1壳蛋白、Ki67联合检测，为HPV-L1壳蛋白和Ki67的联合检测在预测CIN的进展中的价值提供依据。

1 资料与方法

1.1临床资料选取2014年7月-2016年7月在重庆市第五人民医院病理科检测出的HR-HPV阳性、细胞学诊断为ASCUS和LSIL的患者共134例，年龄20～58岁，平均年龄40岁。纳入标准：患者1 a内未行SCC筛查，无子宫切除及宫颈手术史，无宫颈病变史，无盆腔放疗、化疗、免疫低下病史，非妊娠期妇女。排除标准：已经确诊的子SCC患者，已经行全子宫切除的妇女，正在妊娠的妇女，正患有严重内、外科疾病，无法耐受检查者。

1.2标本取样取样前3 d未使用阴道内药物或阴道冲洗，无性生活，非月经期，未接受任何妇科相关疾病治疗。TCT取样采用配套的宫颈刷，于宫颈移行带区取样；将刷下有脱落细胞的宫颈刷置于装有细胞保存液的小瓶中进行漂洗；将保存液瓶放入全自动TCT制备仪中将取样细胞混匀、过滤、转移，制备成单层细胞涂片；95%酒精固定，并采用巴氏染色。HR-HPV检测取样采用同样方法搜集宫颈脱落细胞，通过荧光荧光定量聚合酶链反应(PCR)法进行检测。对所有HR-HPV阳性的ASC-US和LSIL患者行阴道镜活检，阴道镜下对任何醋白和可疑癌变部位均取活检，所有活检标本经福尔马林固定液固定，脱水，石蜡包埋，切片，苏木素-伊红(HE)染色，封片后置于显微镜下观察。

1.3试剂及检测方法TCT细胞涂片制采用新柏氏TCT液基细胞学制备检测仪制备。HR-HPV DNA检测采用上海之江生物科技股份有限公司的HPV分型核酸测定试剂盒荧光定量 聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)法，对高危HPV15种亚型的特异性DNA核酸片段进行荧光PCR分型定性检测。由仪器判读结果。HPV-L1壳蛋白检测使用美国Advanced公司的赛泰-细胞/组织HPV-L1 检测试剂盒检测细胞及组织中的HPV-L1壳蛋白的表达情况，具体步骤按试剂盒说明书逐步进行，高温修复抗原，3-氨基-9-乙基咔唑(3-amino-9-ethyl-carbazole，AEC)AEC显色液显色，苏木素复染，中性树胶封片，镜下观察。以磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffered saline,PBS)液代替一抗作阴性对照。Ki67蛋白的检测单抗Ki67(克隆号SP6)，购于迈新试剂公司，用免疫细胞及组织化学的方法检测细胞及组织中的Ki67的表达，抗原修复采用高压锅高温修复，按二步法操作，二氨基联苯胺(diaminobenzidine,DAB )显色液显色，苏木素复染，中性树胶封片，镜下观察。以PBS液代替一抗作阴性对照。

1.4结果判读宫颈液基细胞学(TCT)ACS-US的诊断标准： 核面积为正常中层鳞状细胞核的2.5～3倍(大约35 μm2)；核质比轻度增高；核轻度深染，染色质分布或核型不规则；核异常伴随胞质的强嗜橘黄色改变。LSIL的诊断标准：细胞大，胞质多而成熟，边界清楚；核增大，面积大于正常中层细胞的3倍，核质比轻度增加；核不同程度深染；双核和多核常见。核染色质均匀粗颗粒状；无核仁；挖空细胞化。HSIL的诊断标准：病变细胞比LSIL的小且较“不成熟”；核深染，细胞大小不一，核增大，核质比明显增高，核膜轮廓很不规则；一般无核仁。组织活检标本判读标准：CIN Ⅰ为鳞状上皮下1/3层细胞核的极性轻度紊乱，大小不等，有轻度异型性；CIN Ⅱ为鳞状上皮下2/3层细胞核异型性更明显，细胞核极向消失，核深染，核分裂和病理性核分裂增多，但上皮上1/3层分化成熟；CIN Ⅲ为鳞状上皮全层细胞核异型性显著，核质比增大，极向紊乱，上皮各层均可见病理性核分裂。HR-HPV DNA检测由电脑自动分析计算出定量结果。 HPV-L1壳蛋白为细胞核表达，液基制片及组织切片中仅有一个鳞状上皮细胞核染色呈红色即判定为特异性阳性染色；Ki67为细胞核表达，以细胞核中见到棕黄色颗粒分布为阳性 。 采用半定量方法进行判断，判断标准为：无阳性细胞即阴性；0～25%为弱阳性(+)；26%～50%为阳性 (++)；>50%为强阳性(+++)。

1.5统计学处理采用 SPSS13.0 软件进行统计学分析，采用卡方χ2检验，Spearman等级相关研究HPV-L1 壳蛋白、Ki67同时计算出各指标的阳性预测值、阴性预测值、灵敏度、特异度。以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1TCT检查与组织病理学检查结果比较ASCUS患者77例，LSIL患者57例。 对134例ASCUS和LSIL患者进行组织活检，其中发现活检结果≥CINⅡ 44例(32.84%)。ASCUS患者中组织活检结果≥CINⅡ的23例(29.87%)，LSIL患者中组织活检结果≥CINⅡ的21例(36.84%)，见表1。

表1 TCT检查与组织病理学检查结果比较

2.2TCT及相应组织学活检中2项免疫标记物检测结果比较HPV-L1壳蛋白检测显示ASCUS患者HPV-L1阳性率为32.47%(25/77)，LSIL患者中HPV-L1阳性率为26.32%(15/57)。相应组织活检确诊为宫颈病变的患者其HPV-L1壳蛋白的阳性率分别为CINⅠ49.21%(33/63)，CINⅡ21.74%(5/23)，CINⅢ8.33%(1/12)，SCC 0%(0/9)，CINⅠ的患者HPV-L1壳蛋白的阳性率明显高于CINⅡ、CINⅢ，SCC组，差异有统计学意义(P<0.05)；CINⅡ组、CINⅢ组，SCC组之间HPV-L1壳蛋白阳性率差异无统计学意义(P>0.05)。ASCUS及LSIL中HPV-L1壳蛋白的表达情况见图1，CIN中HPV-L1壳蛋白的表达情况见图2。

A:ASCUS中HPV-L1壳蛋白的表达

B：LSIL中HPV-L1壳蛋白的表达

图1ASCUS-LSIL中HPV-L1壳蛋白的表达情况(S-P×200)

A:CINⅠ中HPV-L1壳蛋白的表达

B：CINⅢ中HPV-L1壳蛋白的表达

图2CIN中HPV-L1壳蛋白的表达(S-P×200)

ASCUS患者中Ki67阳性率为68.83%(53/77)；LSIL患者中Ki67阳性率为66.67%(38/57)。相应组织活检其Ki67的阳性率分别为CINⅠ60.32%(38/63)，CINⅡ91.30%(21/23)，CINⅢ100%(12/12)，宫颈癌(SCC)100%(9/9)，CINⅡ、CINⅢ、SCC患者ki-67阳性率明显高于CINⅠ患者，差异有统计学意义(P<0.05)；CINⅡ、CINⅢ患者与SCC患者的ki-67阳性率差异无统计学意义(P>0.05)。ASCUS及LSIL中Ki67的表达情况见图3，CIN中ki-67的表达情况见图4。

A:ASCUS中Ki67的表达情况

B:LSIL中Ki67的表达情况

图3ASCUS-LSIL中ki-67的表达情况(S-P×200)

A:CINⅠ中ki-67的表达

B：CINⅢ中ki-67壳蛋白的表达

图4CIN中ki-67的表达(S-P×200)

2.32项免疫标记物单独检测在HR-HPV阳性的ASCUS及LSIL中对预测高级别CIN(CINⅡ及以上)的价值HPV-L1壳蛋白单独检测其阴性表达在HR-HPV阳性的ASCUS中预测高级别CIN(CINⅡ及以上)的灵敏度为86.96%(20/23)，特异度为40.74%(22/54)，阳性预测值38.46%(20/52)，阴性预测值88%(22/25)；在LSIL中预测高级别CIN(CINⅡ及以上)的灵敏度为85.71%(18/21)，特异度为33.33%(12/36)，阳性预测值42.88%(18/42)，阴性预测值80%(12/15)。

Ki67阳性表达在HR-HPV阳性的ASCUS中预测高级别CIN(CINⅡ及以上)的灵敏度为95.65%(22/23)，特异度为42.59%(23/54)，阳性预测值41.51%(22/53)，阴性预测值95.83%(23/24)；在LSIL中预测高级别CIN(CINⅡ及以上)的灵敏度为95.24%(20/21)，特异度为50%(18/36)，阳性预测值52.63%(20/38)，阴性预测值94.74%(18/19)。

2.42项免疫标记物联合检测在HR-HPV阳性的ASCUS及LSIL中预测高级别CIN(CINⅡ及以上)各指标结果ASCUS中预测高级别CIN(CINⅡ及以上)的灵敏度为86.96%(20/23)，特异度为90.74%(49/54)，阳性预测值80%(20/25)，阴性预测值94.23%(49/52)；LSIL中预测高级别CIN(CINⅡ及以上)的灵敏度为80.95%(17/21)，特异度为94.44%(34/36)，阳性预测值89.47%(17/19)，阴性预测值91.89%(34/37)。 2项免疫标记物联合检测在ASCUS及LSIL中预测高级别CIN的特异度、阳性预测值均显著高于2项免疫标记物单独检测，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 HPV-L1壳蛋白、Ki67单独及联合检测ASCUS及LSIL中预测高级别CIN各指标的比较/%

3 讨论

CIN的发生、发展与高危型HPV感染密切相关， CIN发展到浸润癌需要10～15 a[2-3]。因此常规进行宫颈癌筛查，及早期发现并准确诊断CIN，进行合理治疗，是防治CIN的关键。目前常用的CIN筛查方法主要有宫颈液基细胞学检查和HR-HPV检测，2种筛查方法有一定的局限性：由于受临床取材者技术和细胞诊断医师的诊断水平的影响，细胞学筛查中诊断为ASCUS及LSIL的病例中经组织学证实存在一定比例的CINⅡ-Ⅲ级病变[4]；虽然HR-HPV检测对诊断有困难的病变有一定帮助，但由于HPV感染存在潜伏期或一过性，仍然存在着特异性低、准确度不高的问题[5]。这些问题造成诊断的误诊率增加和过度治疗，增加了宫颈病变患者的经济和精神负担[6]。近年来，关于HPV- L1壳蛋白的研究备受关注[7]。HPV基因组包括早期基因区(E)、晚期基因区(L)、长控制区(LCR)3个功能区。HPV- L1壳蛋白是晚期基因区(L)主要编码的结构蛋白，其具有抗原性，是各型HPV病毒的特异性蛋白抗原[8]。Saemadi等[9]研究发现，HPV-L1壳蛋白是HPV预防性疫苗的主要靶抗原。当宫颈基底细胞感染HPV病毒后，随着基底细胞的分化，病毒晚期基因区(L)开始表达并产生大量的HPV-L1壳蛋白，有助于提高机体免疫能力，抑制异常细胞的过度增殖；而当病毒DNA整合到宿主细胞DNA中时，病毒DNA中的某些序列缺失或与启动子分离，不再表达HPV-L1壳蛋白，导致机体的细胞免疫应答无效，引发宫颈病变的进展[10-11]。因此，HPV-L1壳蛋白的检测俨然已成为诊断宫颈上皮内瘤变及预测其进展较有意义的分子标记物。

本研究显示，CINⅠ的患者HPV-L1壳蛋白的阳性率明显高于CINⅡ、CINⅢ、SCC患者，SCC患者HPV-L1壳蛋白为阴性表达。证实随着CIN病变级别增高，其表达率逐渐降低，宫颈高度病变和宫颈癌中更容易出现HPV-L1壳蛋白表达缺失。

Ki-67是一种表达于增殖期细胞中的非组蛋白核抗原，与细胞增殖周期有关，因其半衰期短，可以准确地反映细胞的增殖活性[12]。Kanthiya等[13]研究表明， ki-67在早期宫颈癌进展中有较强的预测作用。本研究结果显示，ki-67阳性率在CINⅡ、CINⅢ、SCC患者明显高于CINⅠ患者。

诊断试验是评价临床测量指标对疾病诊断作用大小的临床试验，其评价的基本方法是用所谓的“金标准”，如组织活检、手术探查、定期随访等确诊区分某病的病人和非病人，再应用待评价的诊断方法盲法测定这些研究对象，通过比较两者的一致性情况对新的测定方法进行评价。评价诊断试验最常用的指标有灵敏度、特异度、阳性和阴性预测值。灵敏度表示实际患病检测结果正确判为有病的概率，其值越高，诊断假阴性的几率越小，漏诊率就越小；特异度表示实际未患病且检测结果正确判为没病的概率，能够反映正确排除某病的能力，其值越大，诊断假阳性的几率越小，误诊的可能性越小。

本研究结果显示，HPV-L1壳蛋白单独检测ASCUS及LSIL中预测高级别CIN(CINⅡ及以上)的灵敏度为86.96%和85.71%，阴性预测值为88%和80%，但其特异度和阳性预测值较低，特异度仅为40.74%和33.33%，阳性预测值仅为38.46%和42.88%(18/42)。Ki67单独检测其阳性表达在HR-HPV阳性的ASCUS及LSIL中预测高级别CIN的灵敏度为95.65%和95.24%，特异度为42.59%和50%，阳性预测值为41.51%和52.63%，阴性预测值为95.83%和94.74%，同样存在特异度和阳性预测值较低的情况。上述问题的存在会导致宫颈病变的误诊率增高，造成临床的过度诊断和治疗，同时造成宫颈病变患者沉重的经济和精神负担。因此急需寻找一种提高特异度的筛查方法来降低其误诊率。

联合试验中的串联试验是指全部试验结果为阳性才能确定为阳性，任意一个试验诊断为阴性，则最终诊断结果为阴性。串联试验可以提高筛查的特异度，从而降低了误诊率。本研究正是应用了串联试验的原理，通过HPV-L1壳蛋白和Ki67联合检测，本研究显示HPV-L1-/Ki67+预测高级别CIN的灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值明显高于其他患者。HPV-L1壳蛋白阴性说明HPV病毒基因已经导入到宿主基因中，Ki67阳性说明细胞增殖活性增加，宫颈病变发生进展。因此HPV-L1-/Ki67+可能是高危表达形式，这些患者中筛查出的高级别CIN的病例的准确性肯定高于其他患者。本研究显示联合检测(HPV-L1-/Ki67+)在ASCUS及LSIL中预测高级别CIN的特异度为90.74%和94.44%，明显高于HPV-L1壳蛋白及Ki67单独检测。

综上所述，本研究采用HPV-L1壳蛋白和Ki67的联合检测，能有效地提高预测高级别CIN的特异度，从而降低了因单独检测所造成的误诊率高的问题。在HR-HPV阳性、细胞学诊断≤LSIL患者中能够精确地反映出其中高级别CIN的患者情况，避免了临床上得过度诊断和过度治疗， HPV-L1壳蛋白和Ki67的联合检测是预测CIN进展的有效、可靠方法。

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