桂腾琴， 王颖娟， 伍 伟， 卢 鹏， 张万芹

（1.兴义民族师范学院生物与化学学院， 贵州 兴义562400；2.贵州省民族药用生物资源研究与开发重点实验室， 贵州 兴义562400）

荷花（Nelumbo nucifera Gaertn.）为睡莲科莲属植物，具有悠久的栽培历史［1］，是中国十大传统名花之一。《中国荷花品种图志》［2］按“二元分类法”原则，分别以种系、株型、花型和花色为分类标准，将荷花分为3系6群，16类48型。而在《中国荷花新品种图志I》［3］中将荷花分为14个品种群，既保留了 “二元”分类法的框架，又符合栽培植物命名的要求。荷花全身都是宝，具有重要的观赏和经济价值。

ISSR （inter－simple sequence repeat）是由 Zietkiewicz等［4］于1994年创建，具有多态性高、稳定性好的特点。但是，在PCR扩增中物种不同，引物不同，ISSR－PCR 最佳反应体系也存在很大的差别［5－8］，即使同一属植物，引物不同，也存在很大的差别。因此，有必要对荷花品种ISSR－PCR反应体系进行优化，为遗传多样性等的后续研究提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

用于研究的荷花品种红苔莲采自于贵州省安龙县十里荷花池。PCR扩增的试剂购于北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。单因素优化反应体系的引物为UBC 811（GA）8C。

1.2 方 法

1.2.1 DNA的提取

红苔莲花瓣DNA的提取采用桂腾琴等［9］的方法，提取的DNA用1% 的琼脂糖凝胶检测质量，用UV－450 1S紫外分光光度计测定DNA的纯度和浓度。

1.2.2 PCR扩增

初始扩增程序为：94℃5min，94℃30s，50.6℃30s，72℃90s，35次循环；72℃7min，扩增产物4℃保存。用1.4%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，EB染色，在Bio－RAD凝胶成像系统中观察、拍照。

1.2.3 引物的筛选

用红苔莲DNA对购买的ISSR引物进行初筛，筛选多态性丰富，条带清晰的引物进行PCR扩增，选用引物UBC 811（GA）8C为单因素的固定引物。

1.2.4 ISSR反应体系优化

荷花品种ISSR－PCR反应体系各参数的设置见表1。

表1 荷花ISSR－PCR反应体系优化设计

2 结果与分析

2.1 Taq DNA聚合酶对ISSR扩增的影响

对PCR扩增影响很大的是Taq DNA聚合酶，浓度过低无扩增条带，浓度过高产生非特异条带，且成本过高。图1显示，Taq 酶浓度为0.50，0.75，1.00U 时，扩增条带比较稳定一致，条带清晰，为了节约成本，选用0.75U为Taq酶的最佳浓度。

2.2 Mg2＋浓度对ISSR扩增的影响

Mg2＋浓度不仅影响PCR反应中Taq酶活性，而且间接对PCR扩增产生影响［10］。试验中设置了7个浓度（图 2），当 Mg2＋浓度分别为 1.00，1.50，2.00 mmol／L时，扩增少带且不稳定。当Mg2＋浓度为2.50 mmol／L时，扩增条带稳定且丰富，选择作为Mg2＋最佳浓度。

2.3 引物浓度对ISSR扩增的影响

设置7个引物浓度，图3显示引物浓度为0.10，0.15，0.20μmol／L和0.25μmol／L时，扩增条带一致，但发现引物浓度为0.10μmol／L时，扩增条带更亮更清晰，为了找到更合适的引物浓度，所以选了2个引物浓度0.10μmol／L和0.25μmol／L来做进一步的研究。

图1 Taq DNA聚合酶对ISSR扩增的影响

图2 Mg2＋浓度对ISSR扩增的影响

2.4 dNTPs浓度对ISSR扩增的影响

dNTPs浓度作为底物对PCR扩增影响很大。选择2个引物浓度0.10μmol／L和0.25μmol／L，进一步做dNTPs浓度对ISSR－PCR扩增的影响。图4是引物浓度为0.10μmol／L时，dNTPs 7个浓度对ISSR影响。图5是引物浓度为0.25μmol／L时，dNTPs 7个浓度对ISSR的影响。图4所示，引物浓度为0.10 μmol／L时，设置的7个dNTPs浓度均有扩增条带且很亮，但条带数少于图5的条带；而引物浓度为0.25 μmol／L时，扩增的条带多且稳定（图5）。图4、图5显示，当 dNTPs浓度为0.10mmol／L 和0.15mmol／L时，扩增条带弱；当dNTPs浓度为0.20～0.40mmol／L时，扩增条带比较稳定且清晰，为了节省成本，选用dNTPs的浓度为 0.20mmol／L，引物浓度为 0.25 μmol／L作为最适浓度。

图3 引物浓度对ISSR扩增的影响

图4 dNTPs浓度对ISSR扩增的影响（引物浓度为0.10μmol／L）

2.5 模板DNA浓度对ISSR扩增的影响

对ISSR－PCR扩增影响很小的是模板浓度，模板浓度为10～60ng／μL时，扩增条带稳定一致，浓度高于80ng／μL时，扩增条带少（图6）。这个结果与桂腾琴［11］和 宋江华［12］的研究结果一致，因此，模板的最适浓度为10～60ng／μL。

图5 dNTPs浓度对ISSR扩增的影响（引物浓度为0.25μmol／L）

图6 模板浓度对ISSR扩增的影响

2.6 退火温度对ISSR扩增的影响

不同物种同一个ISSR引物在PCR扩增中其退火温度也不同。试验设置了6个退火温度：47.6，48.6，49.6，50.6，52.6，54℃，退火温度为49.6℃，50.6℃时，扩增出清晰稳定的条带，当退火温度升高到54℃时，扩增条带明显减少。因此，引物UBC 811的最适退火温度为50.6℃。

2.7 体系稳定性验证

利用引物UBC 827在退火温度为51.6℃ 的条件下对体系稳定性进行检测，图7的扩增图表明体系稳定，多态性条带丰富，为荷花品种遗传多样性、指纹图谱等后续研究奠定基础。

图7 21个荷花品种的ISSR扩增图谱（引物为UBC 827）

3 讨 论

ISSR－PCR反应虽稳定但容易受多种因素的影响，即使同属的植物甚至不同科属植物反应体系中各组分也各不相同［13，14］。ISSR 分子标记技术反应体系中引物、dNTPs、Taq DNA聚合酶等相互影响，Mg2＋浓度决定Taq DNA聚合酶活性，反应体系中一个因子浓度的改变就可能会导致扩增条带减少，条带位置改变等，从而影响整个实验结果。因此，很有必要进行反应体系的优化。

实验发现，引物浓度为0.10μmol／L时，dNTPs 7个浓度扩增的条带虽亮，但条带数明显少于引物浓度为0.25μmol／L 时扩增的条带数，说明在ISSR－PCR反应体系中，引物浓度对PCR 扩增非常重要［15，16］。另外，对PCR扩增影响非常大的是引物的退火温度，李立升［17］运用ISSR技术分析21个荷花品种遗传多样性时，引物UBC 811的退火温度为54℃。范海艳等［18］研究博白大果油茶ISSR－PCR反应体系时，引物UBC 811的退火温度为52℃，实验中引物UBC 811的退火温度为50.6℃，说明同一个ISSR引物在不同品种扩增时其退火温度不同，即使是同一个属的植物采用同一个ISSR引物其退火温度也不同［17，18］。模板浓度对PCR扩增影响最小［19，20］，但如果模板DNA纯度低，将导致无扩增条带或少带［18］。

通过研究最终建立了最佳反应体系：25μL反应体系中含2.5μL 10×buffer、0.75UTaq DNA 聚合酶、0.2mmol／L dNTPs、2.5mmol／L MgCl2、0.25 μmol／L引物、10～60ng／μL模板DNA。

［1］陈俊愉主编.中国花卉品种分类学［M］.北京：中国林业出版社，2001.

［2］王其超，张行言.中国荷花品种图志［M］.北京：中国林业出版社，2005.

［3］张行言.中国荷花新品种图志Ⅰ［M］.北京：中国林业出版社，2011.

［4］Zietkiewicz，E.，Rafalski，A.，Lubuda D.Genome fingerprinting by simple sequence repeat（SSR）－anchored polymerase chain reaction amplified［J］.Genome，1994，20：176－183.

［5］田艳伶，李志辉，杨模华，等.钩栗ISSR－PCR反应体系的建立与优化［J］.中南林业科技大学学报，2015，35（2）：32－37.

［6］任风鸣，胡开治，刘燕琴，等.传统中药金钱草ISSR－PCR反应体系的正交优化研究［J］.中国中药杂志，2014，39（12）：2 233－2 238.

［7］刁松锋，邵文豪，姜景民，等.多用途树种无患子ISSR－PCR体系建立与检测［J］.广西植物，2015，35（6）：899－904.

［8］Pradeep Reddy M，Sarla N，Siddiq E A.Inter simple sequence repeat（ISSR）polymorphism and its application in plant breeding［J］.Euphytica，2002，128：9－17.

［9］桂腾琴，伍伟，卢鹏，等.荷花品种不同部位DNA提取的比较研究［J］.种子，2016，35（7）：41－44.

［10］邹喻苹，葛颂，王晓东.系统与进化植物学中的分子标记［M］.北京：科学出版社，2001.

［11］桂腾琴，乔爱民，陆春连，等.梨品种ISSR－PCR反应体系的优化与应用［J］.广东农业科学，2013，24（12）：117－120.

［12］宋江华，赵颖，汪承刚，等.乌塌菜ISSR－PCR反应体系的建立及优化［J］.植物研究，2013，33（2）：238－242.

［13］唐辉，陈宗游，史艳财，等.正交设计优化地枫皮ISSR－PCR反应体系［J］.中草药，2013，44（5）：610－615.

［14］赵振华，严萍，焦旭雯，等.何首乌ISSR－PCR反应体系的建立与优化［J］.时珍国医国药，2008，5（8）：1 361－1 365.

［15］乔玉山，章镇，房经贵，等.李种质资源ISSR反应体系的建立［J］.果树学报，2003，20（4）：270－274.

［16］冯夏连，何承忠，张志毅，等.毛白杨ISSR反应体系的建立及优化［J］.北京林业大学学报，2006，28（3）：61－65.

［17］李立升.21个荷花品种遗传多样性的ISSR分析［D］.郑州：河南农业大学，2011：20－20.

［18］范海艳，曹福祥，彭继庆，等.博白大果油茶ISSR－PCR反应体系的建立与优化［J］.中南林业科技大学学报，2011，31（4）：97－103.

［19］孙清信，陈坚，张辉，等.紫云英ISSR引物的筛选及PCR反应体系的优化［J］.植物遗传资源学报，2012，13（5）：870－878.

［20］姜静，杨传平，刘桂丰，等.桦树ISSR－PCR反应体系的优化［J］.生态学杂志，2003，22（3）：91－93.