胡美莲，高 阳，李晓露，王丽波

(吉林大学第一医院 小儿消化科，吉林 长春130000)

幽门螺杆菌胃炎(Helicobacter Pylori,Hp)是一种感染性疾病，它与慢性胃炎、消化性溃疡、胃癌、胃粘膜相关淋巴样组织淋巴瘤(MALT)等多种疾病密切相关，根治Hp对上述疾病的预防及治疗非常重要。Hp在人群中的感染率高，我国近一半人口存在Hp感染，随着Hp耐药现象的日趋严重，其根除率正在逐年下降。在临床根治Hp方案中，克拉霉素是最常用的抗生素之一，最新报道指出Hp对克拉霉素的耐药率已达20%-50%[1]。目前一致观点认为，Hp对克拉霉素的耐药机制主要是Hp 23S rRNA V区基因突变，从而导致克拉霉素与Hp结合力下降，无法阻止蛋白质的合成，其中A2142G和A2143G及A2142C为主要突变位点。多数文献已经证实，初次治疗失败将会导致再次治疗耐药率的升高，在初次治疗之前行耐药性检测会提高Hp根除率，且优于二线治疗及补救治疗。下面我们以克拉霉素为例，着重研究Hp耐药性检测方法，探讨快速、敏感的分子生物学新技术，从而有效指导临床用药。

1 传统检测方法

即先培养Hp菌株，再对其进行药物敏感试验(包括纸片扩散法、琼脂稀释法、E-test试验)，此方法被认为是检测Hp对克拉霉素耐药性的“金标准”，但是，由于Hp在体外培养困难、培养周期长、费用昂贵、对操作技术要求高，且不能检测Hp耐药突变位点，故不适合开展临床检验诊断。

2 分子生物学检测方法

2.1聚合酶链式反应-限制性片段长度分析技术(PCR-RFLP):原理是利用PCR技术，对目的基因进行扩增，再利用特异性限制性内切酶对扩增产物进行酶切，得到的酶切产物行电泳迁移率变动分析，通过与标准基因电泳图谱对比，从而检测有无变异。该方法受到很多学者的青睐，他们研究发现突变位点A2142G、A2143G能分别产生BbsI(MboII)、BsaI 酶切位点。Khashei等成功应用该技术在20株耐克拉霉素菌株中，分别检测出18株A2142G(90%)和2株A2143G(10%)位点突变[2]。而Zahra等的试验揭示了在伊朗北部Hp对克拉霉素的耐药率达5.6%(5/89)，且5株耐药菌株全部为A2143G位点突变[3]。Pourakbari等在胃粘膜中直接取样，利用PCR-RFLP技术分析A2142G、A2143G位点突变，提示有17株(50%)发生A2143G位点突变，10株(29%)发生A2142G位点突变，结果准确可靠，相比体外培养方法，明显节省了时间[4]。Gehlot等纳入68名患有消化道疾病的患者，并应用该技术及DNA测序证实，有8株耐药菌株，其中7株(87.5%)发生A2143G位点突变，该结果与其他学者的研究结果相一致，表明该技术特异度和敏感度高，可用来检测Hp耐药[5]。

2.2实时荧光定量PCR(RT-PCR):原理是在PCR扩增时同时加入引物和荧光集团，利用荧光信号对PCR扩增反应进行实时检测，由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值(即扩增循环次数)和该模板的起始拷贝数存在线性关系，故可通过标准曲线对未知模板进行定性及定量分析。Djennanehadibi等在RT-PCR技术中加入特异性物质Scorpion primer，并对阿尔及尔地区Hp行耐药性分析，结果提示该地区Hp对克拉霉素的耐药率为35%(32/91)，其中，81%(26/32)发生A2143G位点突变[6]。同样，在Ducournau 等的大样本试验中，利用RT-PCR方法检测到法国地区Hp对克拉霉素的耐药率为37.9%，该比例略高于药物敏感试验(37.7%)，并指出A2142/2143G为主要突变位点[7]。伊朗学者Hakemi等通过RT-PCR技术直接检测胃粘膜标本，成功扩增20株Hp阳性菌株，其中4株发生耐药突变，解链温度全部为54.7℃，证实发生A2143G位点突变[8]。Xiong等的文章表明RT-PCR检测克拉霉素耐药性具有完美的特异度(100%)及相对较低的敏感度，异质性耐药可能是导致低敏感度的原因，当野生菌株与突变菌株的比值为10∶1时，可能会降低突变菌株的实时PCR检出率[9]。值得注意的是，该技术操作简单、专一、灵敏，较常规PCR具有更高的特异度和敏感度，除此之外，还可用于大量样本检测。

近年来，RT-PCR技术已经被广泛且成功的应用于不同实验室，其不仅可检测胃粘膜标本，还可以检测粪便标本Hp 23S rRNA突变位点。Bakri收集了100例患者的粪便标本，并利用巢式RT-PCR方法进行检测，结果显示该方法的敏感度、特异度以及准确度分别达93%、100%、95%[10]。Redondo等利用巢式RT-PCR技术在Hp感染者的粪便标本中成功检测出A2142G和A2143G位点突变，其结果与胃粘膜标本培养-药敏试验的结果有95%的一致性[11]。RT-PCR技术检测粪便标本Hp 23S rRNA突变位点,具有取材方便、无创、经济、敏感等优点，但需要解决粪便中胆盐、重金属离子、多糖等物质对PCR的抑制，否则易出现假阴性结果。

2.3PCR线性探针分析(LiPA):原理是先用生物素来标记引物，然后利用PCR技术扩增目的基因序列，获得生物素化的扩增产物(即得到探针标记的待测核酸)，再与固定在NC膜上未标记的特殊寡聚核苷酸探针杂交，最后经放射自显影手段就可以判定膜上是否有互补的核酸分子存在。Cerqueira等将该方法用于检测石蜡包埋的胃粘膜标本，同时进行回顾性分析及前瞻性研究，结果显示在回顾性分析中该方法检测Hp对克拉霉素耐药性的敏感度和特异度分别为84.2%、90.9%，同样，在前瞻性研究中也获得较高的敏感度(80.0%)和特异度(93.8%)，表明PCR-LiPA技术对于检测大环内酯类药物耐药性有很高的可信度[12]。此方法不但准确、灵敏，而且能同时检测多位点的突变，尤其存在多重耐药的情况下，其敏感度和特异度仍很高。但受探针的限制，目前该方法仅能检测到7种突变基因，相信随着技术的发展，在不久的将来我们能检测到更多突变类型。

2.43’-错配聚合酶链式反应(3’-mismatchPCR)：原理是在PCR扩增反应中，使用特异性引物(如Cla18,Cla3)，由于3’末端错配导致扩增产物减少，产生片段基因，从而区分突变型与野生型。上述几种分子生物学技术主要用来检测Hp 23S rRNA 2142/2143位点A-G基因突变，然而，有文献报道在一些地区A2142C也是比较常见的突变类型，选择3’-mismatch PCR技术可以对A2142C位点突变进行特异性检测。伊朗学者Abdollahi等运用此方法成功检测出胃粘膜Hp 23S rRNA A2142C位点突变[13]。在Xuan等的文章中指出，学者Elviss等改进3’-mismatch PCR技术后可同时检测出A-G/C突变位点及野生菌株同位基因，并对比RT-PCR和PCR-RFLP技术，证明3’-mismatch PCR检测克拉霉素耐药性时具有更高的特异性[14]。

2.5肽核酸-荧光原位杂交(PNA-FISH)：原理是用特殊修饰的核苷酸分子标记DNA探针，然后将探针直接与完整细胞内的目标序列原位杂交，再用与荧光素分子耦联的单克隆抗体与探针分子特异性结合，最后利用荧光显微镜便可检测到与荧光探针互补的核酸序列。FISH较PCR相比，不需要大量待测核酸，检测方法更为准确、迅速。PNA-FISH技术中应用的是PNA探针，相比传统的DNA探针，它能更好地与目标基因杂交，适宜长度(15 bp)较短，且没有静电排斥[15]。目前，已有众多研究利用该技术检测到Hp对克拉霉素耐药性，且获得高敏感度及特异度[16，17]。该方法虽然快速、准确，但不能检测除克拉霉素以外其他抗生素的耐药性，且具有侵入性，不适合儿童和老人。

2.6基因芯片也被称为DNA微阵列，原理是将许多特定的DNA片段有规律地固定在支持物上，再与荧光探针标记的待测序列杂交，然后通过荧光检测系统对芯片扫描后进行检测分析，从而获得定性、定量的结果。在Xuan等的报告中指出以酶比色法为基础的基因芯片技术检测的耐药性结果与DNA测序结果有96.83%一致性，且有很高的灵敏度和可重复性[18]。该技术能同时检测多种抗生素、多种基因、多位点突变，但高昂的费用使其在临床应用中略显不足。目前在姚雪的文章中建立了一种可同时检测Hp克拉霉素、喹诺酮耐药位点的可视化基因芯片检测方法，其准确性与测序技术相当，不仅快速、敏感，而且大大降低了成本[19]，为我们接下来的研究设计提供了借鉴和指导。

2.7DNA测序作为分子生物学检测方法中的“金标准”，目前该技术：(1)用来验证其他检测方法的可靠性；(2)发现新的其他未知突变。随着高通量测序技术的快速发展，DNA测序技术变得更为直接、准确，可进行多耐药突变检测。Alfizah等收集了161例胃粘膜标本，利用基因测序技术成功检测到Hp对克拉霉素、喹诺酮类抗生素多耐药基因突变[20]。该技术虽然准确可靠，但是因测序仪器昂贵、模板浓度不当、引物设计不合理等原因，目前多应用于科研单位或专业测序公司。

3 结论

马斯特里赫特IV-佛罗伦萨共识报告指出，当Hp对克拉霉素的耐药率达到或超过15%-20%时，选择克拉霉素治疗Hp前应先行耐药性检测[21]。目前，我国Hp对克拉霉素耐药率高，掌握Hp耐药状况对选择正确的治疗方案具有重要意义，而不管是传统药敏-培养试验还是最新的分子生物学方法都尚未在临床得到推广。传统方法因其费时、费力等缺点已不考虑纳入临床诊断，分子生物学检测方法因其专一、快速、敏感成为我们研究的重点。在Hp对克拉霉素耐药性分子生物学检测方法研究中，针对 23S rRNA基因突变，主要应用PCR技术，其中最被看好的是RT-PCR方法，其解决了PCR易污染问题，可以检测胃粘膜、粪便和唾液等标本，不仅准确、灵敏、高效、经济，而且真正实现了定性到定量的飞跃，目前已经越来越多的应用于科研及临床诊断中，相信不远的将来，该技术能得到广泛推广。