何长顶 邵骏

声带从组织学上可分为3层结构：上皮层、固有层和肌肉层。上皮层为黏膜上皮,主要由鳞状细胞组成，作用是保护深层组织；声带固有层是声带发音中联系最密切的组织结构，是位于上皮层和肌层之间柔软的结缔组织，固有层又可分为浅固有层、中固有层和深固有层[1]；固有层深面为甲杓肌。声带上皮及浅表层构成声带的包膜部(cover)，而深层及声带肌合称为声带本体部(body)[2-3]。声带黏膜在发声期间呈波浪形运动，这种力学特性主要依赖于声带组织特殊的结构。很多常见刺激可以导致声带功能紊乱和损害，包括过度发声、化学暴露(如吸入烟雾)、胃食管反流、过敏、插管、外伤、放射性炎症等。良性的声带损伤通常局限在浅固有层，通过禁声和言语训练可以暂时缓解，但有些病变则需要手术治疗解决，如声带小结和声带息肉。手术或其他医源性损伤可能导致声带正常组织纤维化[4]。声带瘢痕的形成会破坏声带黏膜的层次结构，降低固有层的柔软性、损害发声，并且会造成声带黏膜黏弹性的改变和声带的不规则振动，最终引起声嘶。声带瘢痕对耳鼻喉科医师来说仍然是个挑战，因为如今仍缺乏有效的疗法。到目前为止，声带瘢痕的治疗方法主要包括，喉成形术、激光疗法、瘢痕减压切开术、上皮下筋膜移植等。虽然部分患者经上述治疗后，声音质量有所改善，但很难恢复到正常水平。而另一种正在研究的细胞注射疗法很有希望减轻瘢痕的影响，但可能不足以修复大的瘢痕，容易被吸收，需要重复注射。所以对于声带瘢痕可能有效的治疗方法是取代声带黏膜的组织工程技术。本文就声带黏膜组织工程技术的研究进展进行综述。

1 组织工程概述

组织工程学是结合工程学和生命科学，在体外或体内构建组织或器官的新兴学科。原理是以少量种子细胞经体外扩增后与生物材料、细胞因子结合，修复较大的组织或器官缺损，重建其生理功能，达到完美的形态甚至功能修复是其最终目标。根据组织工程学原理，组织或者器官的重建主要包括3个要素：种子细胞、支架材料和生物活性因子。这3种成分要求能自我装配成有组织、有功能的结构，并且不会和个体发生排斥反应[5]。组织工程目前的程序主要包括分离和提纯用于移植的细胞，将细胞与生物材料相结合，以及制作以生物材料为基础的网架和生物活性分子的管理[5]。在临床上，生物材料、生长因子和信号蛋白的应用已经成为现实，这也使人类器官的修复和重生成为可能。构建类似于声带固有层和上皮层的三维(3D)细胞群基质，在切除声带瘢痕后, 用新的有组织结构的细胞外基质和上皮作为替代物, 从而改善声带的振动功能。因此声带的组织工程技术包括生物网架、种子细胞和生物活性因子3个重要方面。Yamaguchi等[6]报道了在3D胶原凝胶基质中重建喉黏膜，发现成纤维细胞和气液面的处理对培养的上皮细胞增殖和分化产生很大影响。近些年，许多声带黏膜的组织工程已经尝试使用脱细胞化的细胞外基质、胶原蛋白和纤维蛋白网架，并植入多能干细胞及其衍生物或体细胞。这些技术已经可以生产出所需要组织结构的黏膜[7]。

2 种子细胞

应用于组织工程的细胞常常以它们的来源分类，如同种异体细胞、自体细胞和异种细胞。如今，常用的种子细胞包括脂肪细胞源干细胞、人类声带纤维原细胞(vocal fold fibroblasts, VFFs)和上皮细胞、口腔黏膜细胞等。这些种子细胞所制成的组织工程声带黏膜已经具备近似天然声带组织的形态学特点。如Ling等[8]分离了人类声带纤维原细胞和上皮细胞，经过培养后发现生物工程黏膜显示出天然组织的形态学特点，包括黏膜形态的蛋白质组、复杂性细胞外基质与黏膜基本屏障功能的形成，这与天然组织十分相似。当移植到犬的声带上时(体外)，这种黏膜可以产生振动并输出声音，这些生理现象和自身组织所产生的很难区分；当移植到人源化的鼠身上时，这种黏膜可以存活并且被人类适应性免疫系统所耐受。Fukahori等[4]选择猎犬自体的口腔黏膜细胞作为种子细胞，用组织工程技术重生声带黏膜。Shiba等[9]将兔间充质细胞分离并培养在纤维蛋白水凝胶中，制成组织工程声带黏膜，然后移植到兔声带上，4周后切除兔声带并进行发音和组织学检测，最终在移植点上发现了黏膜波，证明实现了发音功能。而组织学显示重吸收的纤维蛋白基质、连续的上皮细胞和轻微增加的胶原蛋白与对侧未手术声带相似。组织工程声带黏膜成功地被移植到8只兔上，并且很少出现瘢痕形成及免疫反应。另外，其他常用的种子细胞还有人类胚胎干细胞[10]、骨髓来源间充质干细胞[11]，也取得很好的效果。

3 生物网架

恢复组织结构功能是组织工程的一个重要原则。研究者只有复制正常组织的结构才可能实现预期的功能。种子细胞的生长需要微环境，体内组织特异性微环境决定了组织细胞的分化、成熟。然而在体外复制合成声带固有层细胞外基质(extracellular matrix, ECM)的胶原蛋白、纤维蛋白、透明质酸和各种辅助蛋白，以目前的技术很难完成，所以现在的方法只能在临时网架中复制一些关键要素，这种网架经过改进后在体外可以被植入细胞吸收或者在体内被宿主细胞吸收。支架材料可分为2大类：一是合成的，如人造聚合物和凝胶；二是天然来源的，如细胞外基质、胶原蛋白和多糖。在以生物支架为基础的声带组织工程中，已经有一些比较成功的临床应用，如脱细胞器官基质、生物高分子聚合物、人工合成水凝胶和人工合成高分子聚合物制成的3D网架[12]。

制作脱细胞器官基质需要先移除所有活细胞和可溶性分子，分离出不含有抗原性物质的胶原支架，因此适合不同个体甚至不同物种间的移植。目前来源于脱细胞基质的生物支架材料已经成功在组织工程中应用[11, 13]。如Xu等[14]描述了一种异基因脱细胞ECM网架。制作过程主要是将牛声带固有层标本经过高浓度氯化钠、核酸分解和乙醇脱水处理，达到脱细胞化并且移除免疫原性抗原表位，再将初代培养人VFFs种植到非细胞网架中培养。初步结果显示，这种非细胞ECM支架可以产出有完整基底膜和3D结构的基质蛋白，声带纤维原细胞可以稳定地黏附并渗透这种网架，并有着高度的生存能力和活跃的蛋白合成能力。生物高分子聚合物中的胶原蛋白因为其生理特性和比较好的生物相容性，常应用于组织工程的研究，并且可以被制成水凝胶形式。虽然胶原蛋白可以单独用在纤维原细胞的3D培养中，但是这种重组的胶原凝胶机械强度比较低，容易被迅速降解。胶原蛋白与其他物质的混合物现在也比较多见，经常被用到声带黏膜的组织工程中[15]。如Ling等[8]将经提纯的原代细胞培养在聚合Ⅰ型胶原蛋白中，而Fukahori等[4]也是以Ⅰ型胶原蛋白凝胶作为网架。此外透明质酸研究也较为广泛，因为其不能独自构建3D结构，所以到目前为止在组织工程中常被改性成共聚物。如Farran等[16]将胶原蛋白和透明质酸衍生物(HACHO和HAADH)进行合成，产生2种类型的水凝胶。第1种水凝胶含有通过HACHO稳定的成熟胶原纤维，第2种含有无定性基质穿插固定的不成熟胶原纤维。植入这2种水凝胶的VFFs可以表达多种ECM蛋白，而且这种胶原蛋白-透明质酸合成的水凝胶可以延长VFFs的3D培养时间。

人工合成网架可以提供更多的调控和再生性。由于人造网架缺乏生物基质的内在复杂性，植入细胞仍需要外加的信号分子指导它们的行为。近些年，关于模仿弹性纤维二级结构生物可降解嵌段共聚物的研究较多，如可降解聚氨酯[17](PURs)和聚乙二醇(PEG)。相比非降解性移植物，这些生物材料可以在活体内降解，而且可以促进新组织的再生。针对声带组织工程的研究，Liao等[18]研究功能材料的参数(如筛孔大小、力学性质、生物活性和降解速率)对细胞反应和黏膜柔韧性的作用，他们采用以PEG为基础的水凝胶(PEG30)制成网架(可以通过改变组成来控制其结构)，从而控制其机械力学性能、细胞表达以及基质重塑，结果表明筛孔大小对胶原沉积非常重要。Karajanagi等[19]研究了PEG30在体内的生物兼容性，首先在犬的声带注射PEG30水凝胶，随后使用高速摄影记录声带的振动和发音功能，通过磁共振成像和组织学染色进行3D结构分析。结果显示PEG30对正常的发音功能没有影响。Kwon等[20]选用聚己酸内酯(PCL)和普朗尼克F127为合成材料，内窥镜和组织学分析显示这种PCL/普朗尼克127凝胶混合物与周围环境融合良好，没有炎症反应，是治疗声带麻痹很有前景的生物材料。其他可以用于声带组织工程的生物材料，如聚醚聚氨酯(PEUs)是一种可渗透、可调节的生物材料，来源广泛且价格便宜。研究显示高密度、高质量浓度的PEU框架非常适合模拟活体内声带组织的黏弹性[21]。

4 生物活性因子

生长因子是控制细胞增殖和分化的肽分子，可以调控细胞增殖、分化、基因表达，是组织工程学构建不可缺少的关键因素，所以在临床上广泛研究。其中碱性纤维蛋白原生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)和肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor, HGF)对于声带组织工程尤为重要。Hirano[22]等首次使用bFGF治疗人类萎缩的声带，结果表现为空气动力学和发声参数提高。他们还发现在年老的老鼠中，bFGF显著增加了透明质酸纤维原细胞产物，减少了胶原蛋白的沉积。已有研究[23]表明，透明质酸的增加与瘢痕减少有关，高水平的透明质酸对声带的无瘢痕愈合有帮助。Luo等[24]的研究显示，多种生长因子对声带组织细胞-水凝胶结构的组成有作用,如转化生长因子-β1(TGF-β1)、bFGF和HGF等，其中HGF可以有效刺激透明质酸和弹性蛋白的产生，抑制胶原蛋白的合成。

5 生物反应器

由于声带组织处于一种特殊的环境中，生长在声带组织中的细胞对振动和渐变力高度敏感。这和来自其他组织中的纤维细胞不同，声带的成熟依赖发声来源的机械刺激和激素信号。有研究[6, 25-26]表明，由声带振动产生的力传导可能是成人声带黏膜EMC和分层结构形成的重要因素。近些年的研究目标是开发一种体外模拟人类声带的机械环境。Titze等[27]研究了短期拉伸应变对声带成纤维细胞的作用，将已种植种子细胞的基质放于生物反应器中，以20～200 Hz频率振动，结果显示培养细胞的弹性蛋白、前胶原蛋白纤连蛋白mRNA表达增强。 Wolchok等[28]的研究证实，与声带振动类似的刺激可以影响到几种关键基质和基质相关基因的表达，并且增加ECM蛋白、纤连蛋白和胶原蛋白的积累。所以声带的组织工程需要特殊的生物反应器，用来模仿声带组织所处的机械环境。Zerdoum等[29]设计了一种生物反应器，可以通过空气振动产生振动性刺激，克服了机械驱动振动装置的惯性问题，可以将扬声器产生的振动信号转化为空气振动形式。这种新型的生物反应器使用简单、方便，而且细胞培养表现出较高活力和复制能力。但现在的设备也有一些自身局限性，如振动幅度比正常声带组织小、不能模拟正常发声时声带的双边碰撞等。或者在模拟发音的生物力学刺激下，可能会造成网架结构的破碎，所以也促使研究者寻求更有韧性的网架材料[30]。生物反应器作为一种研究细胞反应的方式对于评价声带组织重建的意义重大。

6 应用研究情况及前景

目前已经有了一些组织工程声带黏膜比较成功的实验研究。如Long等[31]把兔脂肪来源的间充质干细胞种植在3D纤维蛋白凝胶网架中，制作成一种组织工程声带黏膜；然后将16只行单侧声带上皮和固有层切除的兔，分别用重新移植已切除的声带黏膜层和移植制作的组织工程声带黏膜2种方法进行治疗；4周后对声带进行组织结构和发音功能检测。高速摄影显示2种治疗方式后的声带振动相似，闭合良好；而组织学检测显示组织工程声带黏膜层表现出更接近天然的特性。Fukahori等[4]选择猎犬自体口腔黏膜细胞作为种子细胞制作组织工程声带黏膜，然后将其移植到犬黏膜缺损的声带上。2个月后观察声带振动和形态学特点，发现培养的组织工程声带黏膜分成复层上皮和固有层，这和正常人分层的声带黏膜十分相似。频闪喉镜显示在移植处有规律但微弱的黏膜波产生，移植物存活状态良好，并且和周围组织没有明显的界线。

综上所述，人类声带独特的力学特性导致其很容易受到损伤，从而引起声损害和瘢痕形成。声带黏膜的组织工程有着广阔的应用前景，不仅对声带黏膜急性损伤(如外伤和喉癌术后)的修复效果比较好[32]，而且对于声带瘢痕的形成和治疗也有明显的作用[33]。目前各种技术制作的生物支架已经取得了一些令人激动的进步，然而组织工程学声带到目前为止仍不能实现如天然声带般复杂并且多层次结构、空气动力到声音的能量转换和高频振动等功能。目前的多数研究只集中在单个方面，如只研究种子细胞或者生物支架材料。更长远的研究应该将可降解的网架结构、种子细胞的移植、可溶性生长因子的释放和动态的机械刺激相结合，才有可能实现协同效果。

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