冯欣源，钟少正，史 月，王海宇，赵润生，刘 伟 (河北医科大学基础医学院免疫教研室,河北石家庄050017)

1 三阴性乳腺癌（triple-negative breast cancers，TNBCs）与 BRCA-1突变

1.1 TNBCsTNBCs是一种雌激素受体(estrogen receptor,ER)、孕激素受体(progestrone receptor,PR)、表皮生长因子受体2(epidermal growth factor receptor-2,HER2)均呈阴性的乳腺癌,占乳腺癌病例总数的10%～24%。TNBCs通常比其他亚型的乳腺癌更有侵略性,发病较早,容易复发和转移,预后极差［1］。与普通乳腺癌不同,TNBCs对于现在的HER2靶向治疗有耐药性,化疗仍是最有效的方法,但是其长期临床效果并不理想,预后差,复发率高［2］。此外,还有一部分使用PARP抑制剂进行治疗,由于缺乏依赖DNA的同源重组修复,PARP抑制剂通过抑制肿瘤单链DNA修复,导致肿瘤细胞中受损DNA的积累,从而诱导细胞凋亡［3］。

1.2 BRCA-1突变TNBCs与BRCA-1基因突变密切相关。BRCA-1定位于17q21,全长100 kb,为常染色体显性遗传,外显率很高。通过修复同源DNA双链断裂和交联损伤起作用,或是在DNA无法修复的时候使细胞凋亡［1,4］。由BRCA-1突变引起的TNBCs占到总数的70%［5］,其中非沉默突变(错义突变,插入,缺失)相对较多［3］。突变的BRCA-1基因失去了其正常的生理功能,使细胞内发生错误的非同源重组,导致了疾病进展。BRCA-1突变引起了细胞内各种分子水平的变化,其中某些抑癌基因如Rb/P16,TP53功能障碍,多种miRNA的水平改变,以及NAD、PARP-1及其它基底标志物的变化。研究［6］表明在BRCA-1发生启动子超甲基化和突变时,细胞中Rb(视网膜母细胞瘤易感基因)和p16(一种抑癌基因)也发生了功能障碍,并且伴随着细胞内p53蛋白高表达,PTEN缺失,Ki-67水平升高,这说明TP53基因突变与 Rb/P16的功能障碍有协同作用。另外,在TNBCs中,BRCA突变引起了miRNA-200c的表达减少,细胞周期蛋白1(cyclin-D1,CCND1)基因和血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factor A,VEGFA)基因是miRNA-200c的靶基因,miRNA-200c通过对靶基因的调控阻断肿瘤血管的生长。同时另外两种肿瘤抑制miRNA、let-7a和miR-335的表达也明显下调,它们可以调节抑癌基因的活性。这两者说明BRCA-1突变使miRNAs对其靶向基因的调节能力发生改变,从而导致 TNBCs 的发展［7］。 Li等［8］的研究表明,在 BRCA-1突变的TNBCs细胞中,NAD(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)水平升高,NAD依赖的PARP1(聚ADP核糖聚合酶)的水平及活性增加。这为BRCA-1突变引起的TNBCs治疗提供了思路。另外研究证实在TNBCs中基底标志物CK5/6、CK17、EGFR、CK14 的表达增加,Kandula等［9］指出表达多个基底细胞角蛋白的肿瘤细胞更可能有一个功能失调的BRCA-1通路。通过这个特征可以鉴定TNBCs患者的 BRCA-1 基因状态［1,9］。

2 TNBCs的免疫微环境

肿瘤微环境是指除肿瘤细胞本身以外,肿瘤细胞所处的周围环境。肿瘤微环境是一个复杂的炎性环境,包括成纤维细胞、内皮细胞、血管平滑肌细胞等非免疫细胞以及T/B淋巴细胞、巨噬细胞、NK细胞、树突状细胞等免疫细胞和细胞因子网络组成的免疫微环境。通过对TNBCs免疫微环境的研究,我们发现免疫微环境对于TNBCs的发生、生长和转移起着双重作用。各种肿瘤抗原的表达上调为免疫系统识别和肿瘤清除提供了前提。免疫微环境中肿瘤浸润淋巴细胞(tumor-infiltrating lymphocytes,TILs)起到对肿瘤细胞杀伤和清除的作用,但是免疫检查点的高表达抑制了细胞免疫的功能,促进了肿瘤的免疫逃逸［10－11］。

2.1 免疫细胞

2.1.1 CD8+T细胞 在TNBC中,细胞毒性CD8+T淋巴细胞由肿瘤细胞上表达的MHCⅠ类分子激活,从而直接杀伤肿瘤细胞,并且释放干扰素γ发挥抗肿瘤作用,与预后和患者的生存率密切相关［12］。

2.1.2 CD4+T细胞 在TNBs中,CD4+T淋巴细胞由MHCⅡ类分子激活后,基于肿瘤微环境中的细胞因子水平,可向不同方向分化为Th1、Th2、Th17和Treg等多种亚型,这些细胞具有调节B细胞、CD8+T细胞和巨噬细胞等的功能,从而发挥免疫系统的调节作用［13］。

2.1.3 Treg细胞 Treg细胞是具有免疫表型CD4、CD25、fox3p的CD4+T淋巴细胞亚群,Treg细胞在正常免疫环境中的作用是调节和抑制免疫反应,以防止自身免疫反应的发生。在TNBCs中,Treg细胞可以抑制其他效应细胞的作用,从而阻止机体对肿瘤的有效免疫反应［14］。

2.1.4 肿瘤相关巨噬细胞（tumour-associated macrophages，TAMs） TAMs分为两类,一类称为M1型巨噬细胞(经典化巨噬细胞),另一类为M2型巨噬细胞(替代活化巨噬细胞)。M1型巨噬细胞通过释放促炎因子诱导Th1免疫应答,而M2型巨噬细胞通过产生IL-10和TGF-β抑制Th1免疫应答。TAMs发挥肿瘤抑制作用,但是研究证实高浸润的TAMs与不良预后有关［15］。

2.1.5 TILs TILs是浸润在肿瘤局部的淋巴细胞。正常乳腺组织不存在免疫细胞聚集的现象,但TNBCs肿瘤和基质显示更高水平的免疫细胞浸润［12,16］。TNBCs为低分化肿瘤,因此与其他 HER2-乳腺癌亚型相比,可能含有更多的抗原性肿瘤变异［17］。TNBCs特征性表现为边缘推进,中央坏死,基质含量少。这些特征与TNBCs中高水平的TILs相关,即细胞核分级较高,伴有的原位成分较少。TILs增加与ER、PR表达呈负相关,与细胞毒性治疗效果和预后呈正相关,同时与病理完全反应率、病理完全缓解率以及患者存活率呈正相关［18］。所以TILs被认为是TNBCs的预后因素。

三级淋巴组织(tertiary lymphoid structure,TLSs)是TILs的主要来源之一。近日,TLSs的存在已在包括乳腺癌、卵巢癌、肾细胞癌和恶性黑色素瘤等实体器官肿瘤中被确认。TLSs是以高内皮小静脉(high endothelials venules,HEV)为特征的淋巴聚集性异位淋巴结样结构,可存在于炎症部位和肿瘤组织中。邻近组织中的生发中心和大量的TLSs与较高水平的TILs密切相关。 此外,TLS的水平与 CD3－、CD8－、CD20+细胞密度和HEV的密度显著相关。HEV是由立方形内皮细胞特化构成的血管,其内皮细胞表达外围节点地址素(peripheral node addressin,PNAd),PNAd配体在淋巴细胞中表达。因此,PNAd在HEV中的表达有助于淋巴细胞从血管向组织的外渗,并促进TILs的形成,从而促进抗肿瘤免疫。由于HEV有助于TILs的浸润,因此提出了肿瘤免疫治疗的方法,即通过改变内皮细胞的特性来增加免疫细胞的浸润。此外,研究［12,18］认为,高密度HEV乳腺癌患者的无病生存期明显长于低密度HEV患者。

Loi等［19］首次证明,肿瘤和基质层内TIL每增加10%,就会分别降低27%和17%的死亡风险。Loi等后来在研究中证实了这些结果,还发现大量的TILs是远处复发的重要预测因素,TILs每增加10%,远处复发的相对危险度降低13%。单因素和多因素分析中,外周 TILs(危险比［hr］：0.95；95%置信区间［CI］：0.91～1.00；P＝ 0.0354)(HR：0.95；95%CI：0.91～1.00；P＝.0314)与较好的总生存期(overall survival,OS)和无病生存期(disease-free survival,DFS)显著相关,提示TILs的分布在TNBC中可能有重要意义。TILs的水平也可以预测新辅助化疗(Nac)的疗效［14,20］。

2.2 TNBCs免疫微环境中 PD-1/PD-L1、CTLA-4水平免疫检查点是指对于免疫进行负性调节的一组因子。正常情况下,免疫检查点对于维持自身免疫耐受,避免免疫系统对正常组织进行攻击发挥着至关重要的作用。在TNBC的肿瘤微环境中,主要表达的免疫检查点是 PD-1/PD-L1 以及 CTLA-4［21］。

2.2.1 免疫微环境中的PD-1水平 PD-1是一种免疫检查点,由活化的淋巴细胞(T/B细胞、自然杀伤细胞、单核细胞、树突状细胞、髓样细胞、胸腺细胞)表达,参与维持自身免疫耐受［22］。在TNBCs的免疫微环境中,PD-1的水平增加［23］。PD-1的表达受 T细胞活性的影响,并可抑制T细胞活性,减弱T细胞共刺激信号传导［24］。 且 Alsaab 等［24］研究发现,在CD3和TGF-β存在下,Treg细胞的PD-1受体促进了原始CD4+T细胞向Treg细胞的再转化,从而减弱免疫反应。这种转化通过抑制哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)-Akt信号级联反应来增加CD4+T细胞的Treg表达和免疫抑制功能。因此,PD-1的表达不仅抑制了效应T细胞的功能,而且增加了免疫抑制Treg细胞的转化。此外,PD-1激活的Toll样受体9(TLR 9)激动剂可显著促进B细胞的成熟。提示PD-1在抑制B细胞介导的T细胞活化中起着重要作用［24］。

2.2.2 免疫微环境中的PD-L1水平 PD-L1代表程序性死亡配体1,是免疫球蛋白超家族负性刺激分子中参与免疫调节过程的重要成员。在T/B细胞、树突状细胞、巨噬细胞、间充质干细胞、肥大细胞、肿瘤内皮细胞和上皮细胞中表达［25－26］。值得注意的是,PD-L1在肿瘤细胞上也有表达［27］。当主要组织相容性复合物(major histocompatibility complex,MHC)向T细胞提供肿瘤特异性抗原(tumour specific antigen,TSA)时,PD-L1与位于T细胞上的受体PD-1或CD 80(B7-1)结合,向T细胞传递抑制信号,CD80(B7-1)与肿瘤细胞的PD-L1相互作用,形成效应T细胞活化的负调节［13］。由于CD8+T细胞的衰竭,导致肿瘤细胞侵略性增加,分泌多种促炎细胞因子,如肿瘤坏死因子 α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素 2(IL-2) 和干扰素 γ(interferon-γ,IFN-γ)［24］。在BRCA-2突变携带者TNBCs也观察到了其中小部分的肿瘤细胞和间质细胞也表达PD-L1［27］。此外,PD-L1的表达似乎不是由淋巴免疫细胞直接触发的,相反,有证据［28］表明PD-L1的表达受到多种替代机制的调控,其中包括信号通路、转录因子、表观遗传因子和miRNAs的活性。如：在乳腺癌中常见PI3K/Akt通路中的分子损伤,其中磷酸酶和张力素同源物(Pten)的下调或缺失是导致PD-L1表达上调的原因之一。另一方面,PD-L1在肿瘤细胞和造血细胞中的表达是通过刺激促炎细胞因子,如IFN-γ和TNF-α来确定的。活化的T细胞或NK细胞释放的IFN-γ可诱导PD-L1的表达,反之,肿瘤细胞的PD-L1表达可进一步抑制T细胞浸润和IFN-γ释放,从而导致PD-L1表达减少［24］。总的来说,PD-L1表达的调控并不是受单一因素的影响,而是由多种因素共同调控［28］。

2.2.3 免疫微环境中的CTLA-4水平 CTLA-4属于免疫球蛋白超家族,是一种对抗免疫系统的T细胞表面蛋白。CTLA-4抑制CD8+T细胞,减少Foxp3+调节T细胞,抑制调节性T细胞的作用。CTLA-4可在肿瘤细胞中被检测到,可能在非激活阶段抑制抗肿瘤免疫应答［28］。CTLA-4在淋巴组织中的幼稚T细胞早期激活时起作用,其通常在幼稚效应T细胞和调节性T细胞(Tregs)表面低水平表达,可能促进Treg活性。CTLA-4是CD28的同源物,与CD28有两个配体CD80-(B7-1)和CD86(B7-2)。 CD80/CD86-CTLA-4存在于免疫突触中,也存在于免疫微环境中。CD28与抗原提呈细胞(antigen presenting cell,APC)上的CD80/CD86受体结合,介导T细胞的激活,而配体CD80/CD86对CTLA-4的亲和力明显高于CD28。因此,当两个受体在细胞表面同时表达时,CTLA-4介导的抑制信号更受“青睐”。这样的竞争性结合破坏了 CD28 与 CD80 结合所介导的共刺激信号［13,28－29］。CTLA-4的主要异构体为具有细胞外配体结合域和细胞内信号转导域的全长异构体。在TCR介入后,通过CD8+T细胞和CD4+T细胞(包括Tregs)刺激幼稚T细胞,使CTLA-4表达上调,CTLA-4通过其免疫受体酪氨酸基抑制基序(immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif,ITIM)与TCR结合,通过细胞内信号转导域启动抑制信号,从而造成细胞周期阻滞,抑制IL-2的分泌和T细胞的增殖,这主要发生在淋巴结内的启动阶段。当T细胞活化时,细胞内钙水平升高,含有合成前可溶性CTLA-4的分泌颗粒被转运到免疫突触内的中央超分子激活团(Csmac)中,在免疫突触内合成并释放可溶性CTLA-4,而可溶性CTLA-4与b7相互作用,将CD 28排除在中央超分子激活团之外,这减弱了T细胞参与的反应,并防止自身反应性T 细胞的扩散［29－30］。

2.3 TNBCs免疫微环境中肿瘤抗原的水平TNBCs肿瘤微环境中肿瘤抗原主要被分为五类：组织分化抗原,突变抗原,病毒抗原,表观遗传改变后优先表达于肿瘤的抗原,非转换细胞产生的抗原,例如血管细胞和成纤维细胞［31］。以下几种肿瘤抗原在TNBCs肿瘤微环境中表达水平上调。MUC1是一种表达于导管上皮细胞高度糖基化的Ⅰ型跨膜粘蛋白,MUC1起着影响mRNA的稳定性,上调翻译,减少先天免疫刺激,调节转录的作用［32］。DEPDC-1为一种含有DEP结构域的蛋白质,DEPDC-1可能起抑制肿瘤细胞生长,活化抗凋亡通路和调节有丝分裂的作用［33］。NCL是一种多功能蛋白质,定位于正常细胞的细胞核,NCL涉及核糖体的形成,参与新陈代谢,促进miRNAs和rRNA的成熟,从而参与乳腺癌的发生,转移和耐药［34］。Brachyury是由T基因编码的T-box转录因子家族中的重要成员,是一种序列特异性DNA结合蛋白,Brachyury可以促进肿瘤细胞的转移,肿瘤细胞免疫逃逸,诱导上皮间质转化［35］。

3 TNBCs的免疫检查点抑制疗法

3.1 TNBCs免疫检查点抑制疗法的特点研究［36－37］发现,对TNBCs采用免疫检查点抑制治疗后,会产生效果明显的抗肿瘤免疫反应。BRCA-1突变的TNBCs与其他类型的乳腺癌相比,可产生更多能够激活机体免疫反应的肿瘤抗原,另外,在TNBCs肿瘤微环境中还存在更高水平的TILs浸润。而TNBCs肿瘤微环境中大量表达的PD-1/PD-L1以及CTLA-4等免疫检查点抑制了TNBCs患者体内激活抗肿瘤免疫反应的巨大潜力,当PD-1/PD-L1和CTLA-4等免疫检查点被抑制时,机体免疫系统将被激活,产生有效的抗肿瘤免疫反应。研究还发现,给予TNBCs患者免疫检查点抑制治疗联合传统顺铂化疗的治疗方案,将取得更好的抗肿瘤效应［27］。

3.2 疗效以及不良反应如今治疗TNBCs仅可采用传统化疗。由于自身代谢的影响,TNBCs的患者在经过外科手术治疗、化学药物治疗以及放射性治疗后,仍存在较高的复发风险。Khosravi-Shahi等［38］发现,在现阶段众多的免疫疗法当中,免疫检查点抑制治疗对多种恶性肿瘤具有较好的抗肿瘤作用。在TNBCs免疫微环境中,存在着大量的TILs浸润,这标志着TNBCs对于免疫检查点抑制治疗具有良好的反应性。有研究［39］指出,运用免疫检查点抑制疗法就是增强机体自身的抗肿瘤免疫功能,将其由抑制状态转变为激活状态。Weber等［40］的研究表明,与使用传统化疗药物治疗TNBC相比,使用PD-1免疫检查点抑制治疗组患者的缓解率更高。有研究［41－42］通过对TNBCs的分析发现,使用PD-1/PD-L1抗体的单抗原反应比例较低,例如在临床试验atezolizumab 1b中为26%,Javelin phase 1b中为8.6%,因此急需提高PD-1/PD-L1抑制疗法的有效性。Li等［43］的研究提出了新的观点,PD-L1分子上存在糖基化位点,该位点可决定PD-1与PD-L1的相互作用,进而抑制T细胞的活性。抗体药物可通过与PD-L1上的糖基化位点结合从而抑制其功能,另外,特异性的糖基化抗体能够有效促进PD-L1进入细胞内。这将是一种以PD-1和PD-L1的糖基化位点为靶向的治疗策略,在TNBC模型中能够有效增强抗肿瘤免疫效应。Nanda等［44］通过Ⅰ期临床试验：KEYNOTE-012证明运用单抗抑制免疫检查点PD-1和PD-L1的治疗方法对TNBC患者有效,其肿瘤总体反应率(overall response rate,ORR)为18.5%。同时指出,虽然免疫检查点抑制药物有着较好的耐受性,但同时也会引发与免疫相关的特异性不良反应。Hartkopf等［45］的研究表明,运用PD-1/PD-L1免疫检查点抑制治疗通常会导致患者体内自身免疫紊乱,具体机制并不明确,还需要更多的临床研究去验证。自身免疫机制的紊乱可能对各个器官系统的正常生理功能产生影响,常见于皮肤、胃肠道、肝脏、内分泌和呼吸系统。其他较少的不良反应为眼色素层炎、胰腺炎、血液病、神经性疾病以及肾炎。最常见的不良反应为躯干以及四肢皮肤的红斑或者丘疹。

4 结语

免疫检查点的靶向治疗能够对TNBCs起到明确的抗肿瘤作用,将有望显著改善TNBCs患者的预后。最新的研究发现,运用辅助疗法增强免疫检查点靶向治疗效应可能会是免疫检查点抑制疗法未来的发展方向。研究表明,用药时间对免疫疗法的效果起到至关重要的作用,在TNBCs的不同分期给予免疫检查点抑制疗法所产生的抗肿瘤作用有何不同还有待进一步的研究。此外,当前免疫检查点抑制疗法的运用仍停留于临床研究阶段,还有很多亟待解决的问题,如最佳剂量、时间安排、组合方法、应答标准和免疫治疗的生物标志物等。因此,针对TNBCs的免疫检查点抑制疗法还需要更多深入的临床研究。