杜 俊，胡 靖，黄走方 (中国医学科学院北京协和医学院血液学研究所血液病医院,天津300020)

0 引言

2010年,一位名叫Emily的美国小女孩,患有急性淋巴细胞白血病(acute lymphoid leukemia,ALL),经过2疗程化疗后疾病仍在治疗3月后复发。鉴于相关毒副反应,Emily的父母拒绝了医师建议的骨髓移植治疗。Emily又经历了1疗程加强化疗,仍未获得缓解。她父母自愿参加了Pennsylvania大学的一项CART-19的临床研究。幸运的是,CART-19的治疗使她的疾病获得完全缓解,该患者健存至今。但值得一提的是,Emily经历了78%使用CART-19治疗的患者皆会面临的细胞因子释放综合征(cytokine releases syndrome,CRS),并伴有白介素-6(interleukin-6,IL-6)的爆发性增高,但经过托珠单抗(tocilizumab)特异性治疗,她奇迹般获得治愈。诺华公司立即投入119 亿美元开展进一步研究［1－2］。

嵌合抗原受体T细胞(chimeric antigen receptor T cells,CAR-T)是一种新型细胞免疫治疗方法,其通过基因编辑技术,将针对特定靶点的嵌合抗原受体以及共刺激分子引入T细胞之中,从而在非主要组织相容性抗体(major histocompatibility complex,MHC)依赖的条件下结合表达靶抗原的肿瘤细胞,通过共刺激分子激活T细胞进行杀伤。CAR-T细胞能够靶向识别恶性肿瘤细胞抗原,将能够识别该抗原的结构通过基因工程技术的手段使其在患者T细胞的表面,进而特异性地识别恶性肿瘤细胞,最终将其杀灭。

CAR由融合基因表达,该融合基因编码单克隆抗体的单链可变片段(scFv)作为靶向结构域,通过间隔区和跨膜序列与信号传导模块连接。常通过逆转录病毒或慢病毒转导将CAR转基因随机引入细胞基因组中,并从构建体中的病毒或哺乳动物启动子转录。在临床前研究中已经实现CAR靶向整合到内源启动子元件控制下的明确基因组位点,并且可以提供更均质的CAR表达以提高治疗效果。通常,非特异性的T细胞在用促有丝分裂抗体激活后被转导,并且在再输注之前在IL-2中单独或与其他g链细胞因子短暂扩增。因为T细胞由CD4和CD8亚群组成,每个亚群又细分为纯真T(TN)、中枢和效应记忆(TCM/TEM)、组织驻留记忆和效应细胞亚群,这导致CAR细胞产品具有极大的异质性。通过基因编辑技术开发的CAR-T细胞产品可跨越MHC屏障,但也常因残存的TCR+细胞发生移植物抗宿主病(graftversus-host disease,GVHD),颇为棘手［3］。

CAR-T细胞治疗本身即是个体化治疗血液肿瘤的体现,在分子生物学发展日新月异的今天,深入研发CAR-T技术是精准治疗血液病的重要探索方向。

1 治疗疾病领域

1.1 复发难治B细胞淋巴瘤/白血病

1.1.1 复发难治B细胞淋巴瘤 Neelapu等［4］开展的ZUMA-1临床试验及Schuster的小规模试验均显示出CD19 CAR-T显著的有效性。Neelapu纳入的101例复发难治B细胞淋巴瘤,其中54%获得完全缓解；而在Schuster等［5］的试验中,28例患者中57%病情完全缓解。CAR-T疗法在B细胞淋巴瘤中的疗效好,但其疗效持续时间有待进一步观察。

1.1.2 中枢神经系统弥漫大B细胞淋巴瘤（central nervous system-diffuse large B cell lymphoma，CNS-DLBCL） Abramson 等［6］报道了 CD19 CAR-T 治疗CNS-DLBCL的有效性。该患者为68岁女性,诊断为DLBCL(GC型 伴有BCL-2基因重排及MYC、BCL-6复制),经过5个疗程DA-EPOCH-R方案化疗,并接受了全相合的无关供者异基因造血干细胞移植(allogeneic hematopoietic stem cell transplantation,allo-HSCT),仍未治愈。CD19 CAR-T的治疗使该患者获得完全缓解,取得显著疗效。研究人员进一步在患者脑脊液中检验出CD19 CAR-T细胞的存在,也证明CAR-T细胞可通过血脑屏障发挥其治疗作用。

1.1.3 复发难治B细胞急性淋巴细胞白血病（B-ALL）Memorial Sloan Kettering癌症中心的一项随访研究［7］显示：CART-19在复发难治B-ALL中疗效明显。该队列研究纳入53名受试者,均为复发难治B-ALL患者。在这组患者中,完全缓解率为83%,中位生存时间为12.9月。分层研究显示,治疗前疾病负担是生存时间及缓解率的有效预测因子。肿瘤负荷低的患者,其无事件生存率(event free survival,EFS)及总生存率(overall survival,OS)均显著高于肿瘤负荷高的患者。

有研究［8］将CART-19疗法应用于30例复发/难治B-ALL患者,27例(90%)获完全缓解。随访6月,其EFS为67%,OS为78%。随访24月,仍有19例患者处于疾病缓解状态。但即使CART-19疗法存在颇高的近期临床缓解率,若无法及时桥接造血干细胞移植,其长期缓解率仍不如人意。

国内燕达陆道培医院亦有相应尝试。该中心纳入52例B-ALL患者,其中42例为复发/难治患者,经输注剂量为1×105cells/kg的CART-19治疗后,36例(90%)获得完全缓解。中位随访230天发现,82.5%的患者桥接造血干细胞移植未出现疾病复发。根据该中心经验,减低剂量的CAR-T治疗可能缩减了CRS的发生率,同时减少了造血干细胞移植后复发率［9］。

1.2 难治性慢性淋巴细胞白血病（chronic lymphocytic leukemia， CLL）Porter等［10］将 CAR-T 技术用于治疗难治性CLL。该患者为男性,1996年诊断CLLⅠ期,疾病观察6年后患者因淋巴细胞增多及淋巴结肿大接受2疗程利妥昔单抗+氟达拉滨治疗,获得疾病完全缓解。2006年患者因疾病进展再次使用4疗程利妥昔单抗+氟达拉滨治疗,同样获得完全缓解。2009年,患者疾病迅速进展,淋巴细胞增多及淋巴结增大明显,分子生物学检测发现TP53基因突变、17p染色体缺失,预后不良。患者再次接受1疗程利妥昔单抗+苯达莫司汀,以及3疗程苯达莫司汀治疗,疾病未缓解。Porter使用 CD19联合 CD137 CAR-T细胞治疗,采用1.5×105/m2的低剂量输注,而在体内扩增达1000倍,疾病终获完全缓解,随访10月未发现疾病复发进展迹象。同样纳入该试验的另2例患者,亦获得疾病完全缓解。CAR-T细胞治疗在CLL领域不失为有益的尝试。

1.3 多发性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）虽然CD19并非常规表达于浆细胞表面,但CD19 CART细胞疗法治疗MM颇具前景。Garfall等［11］报道的10例患者中,有2例在使用CTL019后,疾病缓解,无进展生存期(progression free survival,PFS)延长。另外,Ramos等［12］将 κ.CAR-T 治疗 MM,4/7获得疾病缓解,病情稳定,该反应甚至优于NHL及CLL。虽然CD138高表达于浆细胞表面,初步试验却显示CD138 CAR-T疗效不佳。 Guo等［13］将 CD138 CAR-T用于治疗5例MM患者,也仅有3例病情稳定(stable disease,SD),表明目前的CD138 CAR-T治疗MM尚无满意疗效。B细胞成熟抗原(B cell maturation antigen,BCMA)CAR-T治疗MM是新的尝试,Ali等［14］报道9例使用BCMA-CART的患者,1例获得sCR(严格意义上的完全缓解),2例获得VGPR(非常好的部分缓解),相关临床试验正进一步开展。尝试新靶点的CAR-T细胞疗法正成为治疗MM的新手段,疗效突出。而CAR-T联合传统化疗、免疫化疗或造血干细胞移植,有望使MM患者获得更好的临床缓解,甚至治愈。

1.4 T细胞淋巴瘤将CAR-T技术用于T细胞淋巴瘤技术难度颇大,因为治疗靶向的抗原也常表达于正常T细胞表面。通过CRISPR/Cas9基因编辑技术靶向CD7的CAR-T技术尝试用于T细胞淋巴瘤,在临床前期研究中显示有效,可发挥抗肿瘤效应［15］。Maciocia等［16］进一步研发出可特异性结合TCRBC1的scFv,这使得CAR-T技术可靶向T细胞亚群而非整个T细胞结构域,这将带来T细胞淋巴瘤治疗的新突破。

1.5 急性髓系白血病（acute myelogenous leukemia，AML）AML较ALL更为常见,且年龄大于60岁的患者对化疗反应差。CAR-T技术治疗ALL的显著疗效,启示临床医师将该技术应用于AML。目前,Lewis Y抗原(LeY)、CD33、CD123及CLL1均作为CAR-T治疗AML的靶点用于临床试验,但遗憾的是,这些抗原亦表达于正常造血前体细胞,且AML的免疫表型异质性限制了这些靶点的功效［17］。靶向LeY的CAR-T治疗收效甚微,而靶向CD123的临床试验正在开展。整合scFvs的CAR-T靶向HLA-A2/WT1正处于研发状态［18］。但CAR-T技术治疗AML的靶点应共表达于AML的表面分子,否则临床有效性将受到限制。

2 主要不良事件

2.1 CRSCRS是CAR-T体内激活和杀伤肿瘤细胞过程中释放大量炎症因子导致一系列临床表现的综合征。CRS的发生颇为常见,临床症状常包括发热、低氧血症、低血压。在ZUMA-1试验中,CRS发生率为 93%；而在 Schuster的试验中,其发生率为57%［5］。由于CAR-T对不同肿瘤作用靶点的差异,CRS的出现时间和强度均有所不同,临床预测模型及治疗手段均为基于大型医疗中心的经验,相关指南和规范仍在研究中。

2.2 神经系统毒副反应神经系统毒副反应常见为脑病、昏迷及震颤。ZUMA-1试验中,其发生率为64%；而在Schuster的试验中,其发生率为39%［5］。T细胞的直接毒性或释放的细胞因子可能为其发病机制。遗憾的是,目前尚未找到合适的神经系统毒副反应预测因子。Abramson等将CART-19治疗中枢DLBCL,发现CART-19细胞可穿透血脑屏障［6］。因此,CART-19 T细胞可能直接损害颅内脏器,有待进一步研究［3－4］。

2.3 感染风险骤然增加Budde等［19］观察到,在CAR-T细胞输注的前28天内,患者感染的发生率高达21%。结合Hay等的研究,Budde等总结其发生机制为循环血液中血管生成素-2和VWF因子造成内皮细胞损伤,使得病原微生物更易侵袭人体。在免疫调节功能紊乱的恶性血液病患者中,该侵袭功能进一步增强,从而使得CAR-T疗法治疗的患者感染率上升。因此,治疗前充分评估患者感染风险是十分必要的。相关研究数据仍然偏少,尚需进一步总结经验。

2.4 治疗相关死亡率ZUMA-1试验中,治疗相关死亡率为3.0%；而在Schuster的临床试验中,治疗相关死亡率为3.6%。该死亡率并不低,但考虑到难治性B-ALL疾病本身的死亡率,亦在接受范围。但减低剂量及支持治疗,包括毒副反应的控制仍至关重要［5］。

2.5 脱靶效应CAR-T细胞并非总能与肿瘤抗原特异性结合,当其与正常细胞组织表达的肿瘤相关抗原结合后,可对正常组织产生毒性反应,谓之脱靶效应。预防脱靶效应,可采取如下方法：①降低单次CAR-T细胞治疗量；②应用抗体封闭正常组织上的肿瘤相关抗原；③构建自凋亡基因系统。

Ruella等［20］近期报道1例因脱靶效应致严重不良事件的案例。研究者在给一名复发/难治性B-ALL的患者制备CAR-T细胞时,因为脱靶,CAR意外地被加到患者癌变的B细胞上,形成了“CAR-癌细胞”。更意外的是,加到癌细胞上的CAR与癌细胞表面的CD19结合,使CAR-T细胞失去了识别癌细胞的靶标。该患者在接受CAR-T治疗的261天之后,由于“CAR-癌细胞”大量增殖,癌症复发,最终死于白血病相关并发症。

3 讨论与结语

尽管CAR-T疗法有着较高的治疗有效性,但半数患者无法获得长期缓解,疾病复发率高,这也使其临床应用受限。研究人员亦采用不同靶点或多靶点联合的CAR-T疗法,如CD22等,可避免肿瘤逃逸,增强CART疗法的有效性。通过CRISPR-Cas9基因编辑技术,在动物模型中CAR-T的抗肿瘤效应得以增强［21］。联合作用于不同信号通路的药物临床研究也在开展,并显示BTK抑制剂及PD-1抑制剂可能增强CAR-T疗法的治疗作用。但这些药物的潜在不良反应尚未完全揭晓,多靶点联合用药有可能进一步增加不良反应事件发生率［22］。

第一代CAR-T细胞治疗局限于单一T细胞靶向效应,植入率较低,故而临床治疗有效率偏低。而第二代(甚至三、四代)CAR-T细胞治疗则部分克服了这种缺陷,因其为多靶点联合治疗,其中CD28及CD4-1BB常为共刺激域,这对CAR-T细胞的存活与增殖 是 有 益 的［23－25］。 联 合 双 靶 点 CD19/CD20、CD19/CD123、CD19/CD22的CAR-T技术正在研发,临床试验初见成效［26－28］。

上述特异性的CAR-T细胞产品制备价格昂贵,工序复杂,探索“通用型”CAR-T细胞技术也是具有潜力的研究方向。如果有更佳的手段克服MHC屏障,那么“通用型”T细胞可能较自体T细胞发挥更好的疗效。源自健康供体的通用型CAR-T细胞具有克服与肿瘤治疗相关的免疫缺陷的潜力。此外,通用CAR-T细胞产品可简化工程细胞制造程序,甚至允许规模化生产。与患者自体特异性T细胞相比,或可取得快速及高性价比的疗效。然而,目前CAR-T细胞是否能单用发挥疗效,结论尚未知。迄今为止,CAR-T疗法常桥接造血干细胞移植治疗。是否将CAR-T疗法作为血液肿瘤常规治疗整体策略的组成部分,需更多临床数据证实。

CAR-T细胞疗法作为新兴治疗手段,前景虽好,但仍处于探索阶段。在伦理及法律程序上,亟待完善CAR-T细胞治疗相关流程。其适用范围、回输时机、治疗剂量、毒副反应及处理存在争议,不宜作为一线治疗,更不应盲目推广。当化疗、抗体治疗或者造血干细胞移植后疗效不佳的患者,可考虑CAR-T细胞治疗。另外,将CAR-T疗法用于治疗实体肿瘤也有潜在的研究价值,这方面的探索正处于重大发现期［29］。