蒋亚楠，于怀海，孙雨飞，付 强，2

(1滨州医学院,山东烟台264003；2北卡罗莱纳大学Lineberger肿瘤中心,美国教堂山27514)

0 引言

自然杀伤细胞(natural killer,NK)是固有免疫系统的重要成员,NK细胞和其它血液细胞一样都是由造血干细胞分化而来,在骨髓中成熟,其成熟程度取决于骨髓的微环境［1］。NK细胞执行杀伤功能时不需要被激活,且无主要组织相容性复合物(major histocompatibility complex,MHC)限制性,可不依赖抗体快速且直接杀伤突变的细胞,具有广谱的抗肿瘤作用［2］。NK细胞可以利用穿孔蛋白把颗粒酶转运到靶细胞内部杀伤细胞,也可以通过NK细胞表面的Fas配体与靶细胞表面的Fas相互作用,从而杀伤靶细胞［3］。此外,抗体依赖的细胞毒作用(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC)通过 Fc受体CD16触发NK细胞对抗体结合的靶细胞的脱颗粒作用来杀伤靶细胞［4］。另外,研究表明NK细胞联合PD-L1抑制剂使小鼠的存活率翻倍［5］,而且NK细胞可以促进树突状细胞向肿瘤内部迁移的数量,提高肿瘤细胞对PD-1免疫治疗的敏感性［6］。因此,NK细胞在肿瘤的免疫治疗中发挥了重要的作用［7］。

肿瘤的生物治疗是肿瘤治疗的第五代治疗模式［8］,而细胞的过继性免疫疗法在肿瘤的综合治疗中发挥着越来越重要的角色。NK细胞的过继性免疫疗法是指在体外激活并诱导培养NK细胞并将其回输到肿瘤患者体内,从而能够发挥直接或间接的肿瘤杀伤作用［8］。嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor,CAR)是一种人工改良的合成蛋白,主要是由胞外抗原识别区域、跨膜结构域、连接子和一系列的胞内信号区域构成,可以使效应细胞以不依赖MHC的方式识别肿瘤表面特异性的抗原,激活效应淋巴细胞并靶向杀伤肿瘤细胞［9］。CAR修饰的T淋巴细胞(CAR-T)可以利用CAR直接识别肿瘤特异性抗原,随即T细胞被激活、增殖,并分泌细胞因子发挥细胞毒性作用,CAR-T细胞对特定的肿瘤抗原表现出了高亲和性和高效杀伤作用。但是,CAR-T细胞治疗也存在着一些问题,如细胞因子风暴、脱靶效应、对实体瘤治疗不敏感、CAR-T细胞的制备周期长以及基因突变的风险等［10－11］。而NK细胞在体内的生存周期短,不会因在体内持续的存在而造成长期的副作用；另外,因CAR-NK细胞的非HLA限制性,可以选用包括干细胞、异体NK细胞和细胞系作为CAR-NK细胞制备的载体；CAR-NK细胞在治疗血液系统恶性肿瘤及实体瘤中相比较于CAR-T细胞具有明显的优势。

1 CAR-NK细胞的结构

CAR-NK细胞与CAR-T细胞在抗原结合区和跨膜区中的结构基本相同,合适的CAR结构对于激活CAR转导的细胞非常重要。CAR结构的构建发展历经三代,从第一代使用含有CD3ζ作为细胞信号结构域到第二代的CD3ζ联合CD28或4-1BB,以及现在的第三代CD3ζ联合CD28和4-1BB［12］。一般来说,NK细胞中的第二代CAR较第一代更为活跃。而体外实验证实,第三代CAR具有更好的靶向特异性和细胞毒性［13］。另外还有根据NK细胞的激活特征,设计出的非典型的CAR构建体,如NKG2D-DAP10-CD3ζ。NKG2D是NK细胞的活化受体,可以激活NK细胞发挥细胞毒性作用,在许多肿瘤细胞上均由NKG2D配体的表达,利用NKG2D取代scFv作为NK细胞胞外抗原识别域,DNAX激活蛋白10(DNAX-associated protein,DAP10)联合CD3ζ共同组成细胞信号结构域［14］,从而构建 NKG2D-DAP10-CD3ζ这种新颖的CAR结构。在NK细胞中,DAP12相比CD3ζ可以更好地传递激活性信号［15］,而DAP10相比CD3ζ的信号激活效率更弱［16］。通过逆转录病毒转导,这种结构可以转入NK细胞增强其对肿瘤细胞的细胞毒性。对于第二代CAR,重要的共刺激分子4-1BB与CD3ζ作为胞内结构域结合,其显著增强了CARNK细胞的靶向裂解［17］。然而,最佳NK细胞活化的CAR构建体组合取决于肿瘤类型或靶抗原,这些CAR-NK细胞对多种肿瘤细胞表现出较强的细胞毒性,在骨肉瘤、前列腺癌和横纹肌肉瘤中观察到非常好的效果［18－19］。

2 CAR-NK细胞的来源

CAR-NK细胞来源丰富,可以由脐带血(UCB)、外周血(PB)、诱导多能干细胞(iPCSs)、人胚胎干细胞(hESCs)甚至NK-92细胞系提供［18］。UCB为免疫治疗提供了一种异基因的、非自身来源的 NK细胞［20］。研究用含有CD19、白细胞介素15(Interleukin 15,IL-15)和诱导型 caspase-9自杀基因(Induced caspase-9,iC9)的逆转录病毒转染UCB来源的NK细胞,结果表明,转染后的NK细胞对表达CD19的肿瘤细胞和原发性白血病细胞都表现出了高效的杀伤作用,并且在异种移植Raji淋巴瘤小鼠模型中小鼠的存活率获得了显著地延长［21］；IL-15转染的UCB-NK细胞可进一步改善NK细胞的功能。另外iPSC也可以作为CAR-NK细胞的来源,通过整合NKG2D跨膜结构域改进的CAR可以增强其抗肿瘤的活性,并且在卵巢癌异种移植模型中,iPSC来源的NK细胞与其他来源的NK细胞相比,能够显著抑制肿瘤生长并延长小鼠的生存期［22］。NK-92细胞来自一名非霍奇金淋巴瘤患者,其特征为 CD56brightCD16neg/low NKG2A+ 和 KIRnegative(KIR2DL4 除外)［23］。 临床一期实验证实了即使使用了高达1010个/m2剂量的NK-92细胞,NK-92细胞的输注也是安全的。NK-92细胞群是一类细胞系,在良好的培养条件下容易扩增,可用于更广泛的临床应用,因此CAR修饰的NK-92细胞可以批量成品生产［24］。一般肿瘤细胞系来源的NK细胞,在输注之前必须经过照射。而活化的PB-NK细胞表达更广泛的活化性受体,并且可以不用照射就可以在体内扩增［18］。来源于iPSC或hESC的NK细胞结合了PB-NK和NK-92细胞的优点,它们表现出与PB-NK细胞相似的表型,并且又是自体同源细胞［18］。因此,在使用非病毒基因方法转染时,来源于hESC或iPSC的NK细胞中的这种CAR结构更容易表达广泛的活化性受体并且可以不经照射在体内回输［25］。

3 CAR-NK细胞在肿瘤过继免疫治疗中的优势

尽管CAR-T细胞在早期达到了治疗效果(特别是在恶性血液病肿瘤中),但是大规模临床应用CAR-T细胞治疗可能受到个体化治疗的限制和副作用的影响。鉴于这些问题,CAR-NK细胞在免疫治疗中表现出了极大的优势。①安全性：CAR-NK细胞可能比CAR-T细胞更安全。临床使用NK细胞免疫治疗的安全性已在多个临床领域得到验证［18］。例如,临床I/II期试验显示,同种异体NK细胞输注耐受性好,不会导致移植物抗宿主病(Graft-versus-host disease,GVHD)和严重的毒性［26］；所以,NK 细胞可以不限于自体细胞来驱动CAR发挥作用。CAR-T细胞治疗的主要副作用之一是靶向脱离肿瘤(on-target/off-tumor)的作用。例如,由于T细胞的细胞记忆性和正常成熟B细胞的侵袭,CD19靶向CAR-T细胞可导致严重而持久的B细胞缺陷［27］。不同的是,CARNK细胞在体内的存活期短使用寿命有限,几乎没有脱靶效应。此外,NK细胞产生的细胞因子的类型与T细胞产生的细胞因子不同［28］；活化的NK细胞通常产生干扰素γ(IFN-γ)和粒细胞巨细胞集落刺激因子(GM-CSF),而CAR-T细胞诱导的细胞因子风暴主要由促炎细胞因子如肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factor,TNF-α)、白细胞介素 1(IL-1)和 IL-6等介导［18］。②诱导抗原特异性靶细胞裂解：除了通过CAR特异性杀死靶细胞机制(scFv识别肿瘤相关抗原),NK细胞还可以通过识别激活受体的多种配体杀死肿瘤细胞。当肿瘤细胞上表达应激诱导的配体或在长期治疗肿瘤过程中,这些NK细胞的活化性受体才会在免疫系统的介导下识别配体。此外,NK细胞还可以通过FcγRIII(CD16)介导ADCC作用来杀伤肿瘤细胞。因此,CAR-NK细胞可以通过CAR依赖性和NK细胞受体依赖性机制来杀死靶细胞,以消除肿瘤相关抗原阳性的肿瘤细胞或表达NK细胞受体配体的肿瘤细胞。临床试验表明,CAR-T细胞不能根除高度异质性的肿瘤细胞,而CAR-NK细胞可以有效地根除长期治疗后可能改变其表型的残留肿瘤细胞。

4 CAR-NK细胞在肿瘤过继免疫治疗中面临的挑战

尽管CAR-NK细胞在肿瘤过继免疫治疗中发挥着重要的作用,但其在临床应用中面临的挑战也不容忽视。①潜在的致瘤性及EB病毒易感性：由于NK-92细胞来源于非霍奇金淋巴瘤患者,为了保证临床应用的安全性,NK-92细胞系的过继免疫治疗必须经过辐照才能使用［28］。NK-92细胞系在使用前务必进行灭活的这一特点也限制了NK细胞在体内的扩增和生存［29］。②生存期短：目前,CAR-NK细胞临床应用的挑战主要是生存期短,因此临床使用需要频繁注射［30－31］。能够尽快获得足够的NK细胞用于过继性治疗是免疫疗法中令人关注的问题。使用细胞因子来扩展人NK细胞是最常用的方法之一。IL-2是刺激NK细胞增殖和激活的细胞因子,其通常需要2～3周。结果表明,经免疫磁珠纯化的CD56+NK细胞在体外可以被IL-2激活12天［32］。虽然存活时间增加了,但是NK细胞的数量仍然不能满足CAR-NK细胞的治疗需求。③CAR载体的转染难点：限制CARNK细胞批量生产的限制性条件主要为NK细胞转染效率,目前使用的转染方法主要分病毒转染和非病毒转染这两种类型,而逆转录病毒和慢病毒转染体系又是最常用的病毒转染系统［33］。病毒载体能够保证稳定的转基因表达并被修饰基因技术编辑,如规律成簇间隔短回文重复(CRISPR)作为第一个用于遗传的病毒载体修饰 NK细胞,其转导效果达到了93%［32］。逆转录病毒载体转导需要细胞分裂,慢病毒载体可以在不分裂的细胞中实现转导而不改变细胞功能、表型和增殖能力。然而,慢病毒转导后NK细胞的生存能力可能会受损,因此有时需要多个转导后才能达到目标疗效。为了克服个体间和实验间的变异、插入突变的风险和细胞分裂的依赖性,可以通过电穿孔或脂质体实现转染。电穿孔可以通过短的电脉冲在细胞膜上产生小孔,从而形成“隧道”转移编码材料,如DNA和RNA。虽然脱靶毒性的风险降低了,但与依赖病毒媒介的方法相比,DNA转染的效果要差很多［34］。mRNA电穿孔后CAR的表达短暂,因此细胞毒性也是短暂的。所以,CAR-NK细胞的转导方法仍需进一步改进,也有必要对用于NK细胞的CAR结构进行筛选和优化。

5 总结

NK细胞是机体重要的免疫细胞,不仅与抗病毒感染、免疫调节、超敏反应和自身免疫性疾病的发生有关,而且在肿瘤治疗中发挥着重要的作用,其能够识别并杀伤肿瘤细胞。免疫治疗正在迅速发展成为癌症治疗的“第五支柱”,越来越多地与外科疗法、化疗、放疗和靶向治疗等癌症治疗联合使用。虽然CAR-NK细胞现在面临的转染难点以及潜在病毒感染性带来的巨大挑战,仍需要大量的研究。但是在肿瘤的过继免疫治疗中,NK细胞及CAR-NK细胞由于本身所具有的独特的免疫识别和杀伤机制的特点,将其批量化生产并应用于临床的肿瘤治疗即将会获得非常显著的疗效。