牟 浪，吴正升，吴 强

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，其发病率呈逐年上升趋势，占中国女性癌症的15%，同时也是全球女性癌症死亡的首要原因[1]。肿瘤的转移和复发是乳腺癌患者致死的主要原因[2]，因此探索肿瘤转移的机制，改善乳腺癌患者的预后至关重要。CD98hc(也称为4F2hc/SLC3A2)是溶质载体家族的一员，相对分子质量为8.5×104的单跨膜糖蛋白[3]。CD98hc可通过激活Integrin信号通路，促进肿瘤细胞与细胞外基质之间的黏附能力减弱，从而使肿瘤细胞易发生迁徙、转移，导致恶性程度增高，预后不良[4]。本实验通过RNA干扰技术沉默乳腺癌细胞MDA-MB-231中CD98hc分子的表达，分析其对MDA-MB-231细胞增殖侵袭力的影响，为进一步阐明乳腺癌侵袭迁移机制提供实验依据。

1 材料与方法

1.1材料与试剂兔抗人CD98单克隆抗体购自Abcam公司；小鼠抗人β-actin单克隆抗体购自Calbiochem公司；TRIzol购自Invitrogen公司；RNA反转录试剂、实时荧光定量PCR试剂购自TaKaRa公司；MTT试剂盒购自Promega公司；Transwell小室购自Corning公司；Lipofectamine 2000购自Invitrogen公司；MDA-MB-231细胞购自美国ATCC细胞库。

1.2方法

1.2.1CD98hc-shRNA真核表达载体构建 根据shRNA设计原则，靶向设计CD98hc的shRNA，上游：5′-CCGGTGCTGAGGTTACAGTAGAAACGGATCC GTTTCTACTGTAACCTCAGCATTTTTG-3′，下游：5′-A ATTCAAAAATGCTGAGGTTACAGTAGAAACGGATCC GTTTCTACTGTAACCTCAGCA-3′。退火处理：95 ℃ 5 min，85 ℃ 5 min，75 ℃ 5 min，70 ℃ 5 min，4 ℃保存。用SolutionⅠ连接酶将准备好的插入片段连接到载体Plko.1，转化到感受态细胞。挑取菌落，抽取质粒，酶切并鉴定。

1.2.2细胞培养 MDA-MB-231细胞培养于含10%FBS、2%L-谷氨酰胺的DMEM高糖培养基中，置于37 ℃、5%CO2培养箱，适时更换培养基和传代。实验时选取处于对数生长期的细胞。

1.2.3MDA-MB-231稳转细胞系构建 取对数生长期的MDA-MB-231细胞2×105个接种于6孔板中，继续培养，待融合度达60%按质粒 ∶脂质体=1 ∶2的比例转染实验组CD98hc表达质粒(CD98hc-shRNA)、对照组空载质粒(Vector)，具体操作步骤按Lipofectamine 2000试剂盒说明书进行，培养48 h后按4 μL/mL添加Puromycin, 适时更换培养基。分别获得下调CD98hc的MDA-MB-231细胞株和对照MDA-MB-231细胞株。收集细胞进行Western blot和qRT-PCR技术鉴定，鉴定成功后用于后续的实验。

1.2.4Western blot检测 收集待检测细胞，细胞裂解液提取蛋白后进行10%SDS-PAGE凝胶电泳，湿转至NC膜后，应用5%脱脂牛奶封闭1 h，一抗4 ℃孵育过夜，PBST洗膜3次加入二抗，室温孵育1 h，洗膜3次，化学发光，采集图像。

1.2.5qRT-PCR检测 采用qRT-PCR法检测CD98hc的mRNA表达。收集待检测细胞，利用TRIzol提取细胞总RNA，按TaKaRa反转录试剂盒操作说明进行反转录。CD98hc定量PCR引物上游：5′-TCCGACTCTACCAGCTGATGC-3′，下游：5′-AAGCTG GACTCATCCCACAGC-3′。GAPDH引物序列上游：5′-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3′，下游：5′-GGCA TGGACTGTGGTCATGAG-3′。引物序列合成由上海生工公司完成。反应条件：预变性94 ℃ 30 s，94 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，退火温度后采集荧光信号，合计40个循环，实验重复3次。将所得数据导出，绘制柱状图。

1.2.6MTT实验检测MDA-MB-231细胞活力 常规洗涤并用胰酶消化待检测的细胞，制成单细胞悬液，每孔1×103个细胞接种于96孔板中，每个处理组重复6孔，合计培养5个96孔板。于24 h后检测细胞活力，弃培养液，每孔加入100 μL MTT液，置培养箱孵育2 h。弃上清，每孔加入DMSO 100 μL。震荡10 min，在570 nm处测定各孔吸光度OD值，结果取平均值。

1.2.7Transwell实验检测MDA-MB-231细胞侵袭迁移能力 用胰酶消化各组细胞，PBS洗1～2次，用含10 g/L的BSA无血清培养基重悬，每组取1×105个细胞加入预先用Matrigel包被基膜的Transwell小室的上室中，下室加入含血清的完全培养基600 μL，培养48 h。培养结束后，取出小室，PBS清洗，用棉签小心擦去微孔膜内层的细胞，90%乙醇固定30 min，0.1%结晶紫染色15 min，倒置显微镜下观察，每个样本随机计数5个视野，取平均值，绘制柱状图。检测细胞迁移时，小室上室中不需要Matrigel包被基膜，其他步骤与之相同。

2 结果

2.1细胞中CD98hc的表达应用qRT-PCR检测CD98hc的mRNA水平表达，发现与空白组(1.040±0.056)、对照组(1.293±0.006)相比，实验组(0.527±0.045)在mRNA水平表达明显下调(P<0.05)，空白组与对照组差异无统计学意义(P>0.05，图1A)。Western blot检测结果显示：CD98hc-shRNA组CD98hc蛋白表达明显下调，蛋白表达的抑制作用明显(图1B)。

图1 A.qRT-PCR检测MDA-MB-231细胞CD98hc干涉情况；B.Western blot检测MDA-MB-231细胞CD98干涉情况

2.2下调表达CD98hc分子抑制MDA-MB-231细胞增殖应用MTT实验检测CD98hc分子对MDA-MB-231细胞增殖的影响，结果发现48 h后CD98hc-shRNA组(0.580±0.035)细胞的增殖与空白组(0.706±0.013)、对照组(0.724±0.018)相比受抑制，差异有统计学意义(P<0.05)；空白组与对照组差异无统计学意义(P>0.05，图2)。

图2 MTT检测CD98hc分子对MDA-MB-231细胞的增殖抑制作用

③A③B③C④A④B④C

图3下调CD98hc显著抑制MDA-MB-231细胞侵袭能力：A. 空白组；B. 对照组； C. CD98hc-shRNA组图4下调CD98hc显著抑制MDA-MB-231细胞迁移能力：A. 空白组；B. 对照组； C. CD98hc-shRNA组

2.3下调表达CD98hc分子抑制MDA-MB-231细胞侵袭及迁移应用Transwell实验检测细胞侵袭及迁移的能力，结果发现CD98hc-shRNA组(108±4.5)穿过Matrigel包被的细胞数与空白组(377±20.9)、对照组(394.6±9.8)相比明显减少(P<0.05)。穿过未包被的微孔膜的细胞数CD98hc-shRNA组(118.4±13.1)也明显少于空白组(385.2±27.3)和对照组(405.2±13.8)，差异有统计学意义(P<0.05)；空白组与对照组相比，差异无统计学意义(P>0.05，图3、4)。

3 讨论

CD98hc首次被发现是作为T淋巴细胞的表面抗原[5]，随后发现CD98hc在多种细胞中广泛表达。大量研究发现，CD98hc具有双重功能，其中胞膜外区可通过二硫键与6种L型氨基酸转运体(LAT1、LAT2、xCT、y+LAT1、y+LAT2和asc1)共价结合，构成的氨基酸转运体是其运输氨基酸的必需组分[6-7]，保证肿瘤细胞对氨基酸的大量需求，维持肿瘤细胞的快速增殖能力[8]。CD98hc的胞质区可通过调节Integrin样信号通路来改变细胞的存活、迁徙甚至是转移[9]。

CD98hc在多种肿瘤细胞表面高表达，与肿瘤的发展密切相关[10]。Fei等[11]报道，CD98hc在非小细胞肺癌组织中高表达，且与CD98hc阴性的肺癌患者相比，CD98hc阳性患者总体生存率减低、复发率增高。Shin等[12]发现SLC3A2基因能与神经调节素1(neuregulin 1, NRG1)融合，该基因融合能够促进肺癌细胞的增殖、侵袭迁移。CD98hc可通过增强Rho激酶(ROCK)的活性以及YAP/TPZ 的转录，介导肿瘤微环境中细胞外基质重塑，促进胃肠道的转移[13]。CD98hc还可与左旋氨基酸转移蛋白1(L-type amino acid transporter 1, LAT1)结合，参与调节肿瘤细胞的生长、迁移和侵袭[14]。Poettler等[15]实验得出在肾透明细胞癌中沉默CD98hc的表达能够一定程度抑制细胞的增殖、转移等肿瘤特性。该现象在胶质瘤中也有发生[16]，但在乳腺癌中还未见相关报道。本组实验结果显示：沉默CD98hc在乳腺癌细胞MDA-MB-231中的表达可以明显抑制细胞增殖及侵袭迁移能力，与其他肿瘤的研究结果一致。提示CD98hc可能参与乳腺癌细胞生物学行为的调控，但关于其调节肿瘤生物学行为的作用机制还有待于进一步分析。

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