任志敏，古雅丽，李新敏，张 瑶

目前，乳腺癌发病率居于女性肿瘤的第一位，美国癌症协会的调查数据显示，2016年乳腺癌预计新发病例249 260例，死亡40 890例[1-2]。因此，寻找新的乳腺癌靶基因对乳腺癌的预防和治疗具有重要意义。随着靶向治疗的发展，miRNA在乳腺癌中的应用已成为研究的热点[3-4]。miR-3619-5p是近年发现的具有明显抑癌效应的miRNA[5-6]，在乳腺癌细胞中作用尚未见报道。本文以体外培养的人乳腺癌细胞MCF-7和T47D为实验对象，观察miR-3619-5p对乳腺癌细胞增殖能力的影响及探讨可能的分子机制。

1 材料与方法

1.1材料has-miR-3619-5p mimic、对照组(转染dsControl)和5-乙炔基-2′脱氧尿嘧啶核苷(EdU)细胞增殖检测试剂盒购自广州锐博公司；Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒购自江苏凯基公司；流式细胞仪购自美国BD公司。人乳腺癌细胞系MCF-7和T47D购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心；胎牛血清和DMEM培养基购自美国Gibco公司； Lipofectamine 3000、Opti-MEM购自美国Invitrogen公司；qPCR试剂盒购自日本TaKaRa公司；PCR引物合成购自上海生工公司；BCA protein assay kit购自美国Pierce公司；一抗鼠单抗GAPDH、兔多抗p21、CDK6和Cyclin D1，均购自美国Cell Signaling Technology公司；辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗羊抗兔/鼠购自美国Affinity公司；ECL显影液购自美国Millipore公司；其余试剂购自上海碧云天公司。根据文献设计miR-3619-5p和dsControl序列，miR-3619-5p与p21基因启动子结合区域详见图1；dsControl是与人类基因组无序列同源性的dsRNA[6-7]；根据Primerbank数据库设计GAPDH、p21、CDK6和Cyclin D1的引物(表1)。

表1 miR-3619-5p、dsControl序列及qRT-PCR引物序列

图1 miR-3619-5p与p21基因启动子结合区域

1.2方法

1.2.1细胞培养和转染 在37 ℃、CO2体积分数为5%饱和湿度培养箱中使用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基培养人乳腺癌细胞系MCF-7和T47D。根据Lipofectamine 3000说明书进行转染实验。

1.2.2EdU细胞增殖实验检测乳腺癌细胞增殖能力 转染实验后24 h，将乳腺癌细胞以每孔6 000个接种于96孔板中，继续培养24 h，使细胞融合度达60%。每孔加入100 μL稀释EdU溶液，继续孵育2 h。根据EdU细胞增殖检测试剂盒说明书进行细胞固定、Apollo染色、DNA染色，荧光显微镜下进行观察拍照，随机选取4个视野计数细胞，计算增殖率。

1.2.3集落形成实验检测细胞增殖能力 转染后24 h，按1×103个/孔接种于6孔细胞培养板，连续培养10天；PBS溶液洗3次；1 mL甲醇固定15 min；0.1%结晶紫溶液固定30 min；流水缓慢洗去结晶紫染液，空气干燥，倒置显微镜下计算集落形成率。

1.2.4流式细胞术(flow cytometry, FCM)检测细胞周期分布 转染实验后72 h，进行胰酶消化，预冷的PBS溶液洗3次；70%乙醇溶液重悬后，置于4 ℃冰箱内固定过夜；离心1 000 r/min，取细胞沉淀，1 mL PBS溶液洗3次；加入100 μL RNAse，37 ℃水浴箱孵育30 min；加入100 μL PI混匀，4 ℃避光孵育30 min；流式细胞仪进行单色荧光细胞流式计数，使用Multicycle软件(美国Beckman公司)进行细胞周期分析。

1.2.5细胞凋亡检测 转染实验后72 h，使用胰酶消化收集细胞，按照Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒说明书进行操作，流式细胞仪检测。

1.2.6RNA提取及定量检测 转染后72 h收集乳腺癌细胞，分别用Trizol提取各组细胞RNA，使用逆转录酶和olige(dT)逆转录RNA为cDNA。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)为内参，合成的cDNA使用荧光定量PCR试剂盒及特异性引物通过PCR仪进行扩增检测，最终结果采用2-ΔΔCt方法分析。

1.2.7Western blot检测细胞中相关蛋白表达变化 转染72 h后收集乳腺癌细胞，用预冷的PBS洗3次，加入RIPA细胞裂解液，4 ℃裂解30 min，提取总蛋白。使用BCA protein assay kit测定蛋白浓度。每个样品提取30 μg蛋白上样，采用10%的SDS-PAGE胶进行电泳分离，使用PVDF转膜后用含5%牛血清白蛋白的TBST溶液室温封闭后，分别与特异性一抗GAPDH(1 ∶3 000)、p21(1 ∶2 000)、CDK6(1 ∶1 000)、Cyclin D1(1 ∶2 000)在4 ℃下孵育过夜。二抗(1 ∶1 000)室温下摇床孵育；条带滴加ECL试剂曝光显影。

2 结果

2.1EdU细胞增殖实验检测细胞增殖变化与dsControl组相比，转染miR-3619-5p后细胞EdU阳性细胞数显著降低(P<0.05)，提示miR-3619-5p可抑制乳腺癌细胞的增殖能力(表2)。

表2 miR-3619-5p对乳腺癌细胞增殖能力、凋亡率的影响

miR-3619-5p组与dsControl组比较，P<0.05

2.2集落形成实验检测细胞增殖能力与dsControl组相比，miR-3619-5p组细胞形成的集落大小和集落数均明显减少(P<0.01)，表明miR-3619-5p可导致乳腺癌细胞增殖能力显著降低(表2)。

2.3FCM法检测细胞周期分布转染miR-3619-5p后与dsControl组相比，MCF-7和T47D细胞在S期和G2/M期细胞比例明显减少，G0/G1期细胞比例显著增加(P<0.05，表3)，表明miR-3619-5p可抑制乳腺癌细胞周期的进展；MCF-7和T47D细胞凋亡率明显上升(P<0.01，表2)，提示miR-3619-5p可诱导乳腺癌细胞的凋亡。

表3 miR-3619-5p对乳腺癌细胞周期的影响

miR-3619-5p组与dsControl组比较，P<0.05

图2 miR-3619-5p过表达对乳腺癌不同细胞表达的影响

A.MCF-7中p21表达；B.MCF-7中CDK6表达；C.MCF-7中Cyclin D1 mRNA表达；D.T47D中p21表达；E.T47D中CDK6表达；F.T47D中Cyclin D1表达；*P<0.01

2.4qRT-PCR法检测p21mRNA表达转染miR-3619-5p后与dsControl组相比，MCF-7和T47D细胞中p21 mRNA的表达分别上调4.70倍(P<0.01)和3.76倍(P<0.01)；CDK6 mRNA的表达分别下调至48%(P<0.01)和42%(P<0.01)；Cyclin D1 mRNA的表达分别下调至34%(P<0.01)和28%(P<0.01，图2)。

2.5Westenblot法检测蛋白表达与dsControl组相比，miR-3619-5p组可见p21蛋白表达明显升高，CDK6和Cyclin D1蛋白表达明显降低(图3)，提示miR-3619-5p可显著激活乳腺癌细胞中p21蛋白的表达。

图3 miR-3619-5p过表达对乳腺癌细胞中p21、CDK6和Cyclin D1蛋白表达的影响

3 讨论

RNA激活作用(RNAa)是新近发现的小分子RNA可上调低表达基因如抑癌基因的现象，这一特征使RNAa具有肿瘤靶向治疗研究的潜在价值[8]。与传统的RNA干扰作用(RNAi)不同，RNAa的确切机制尚不明确[9]。目前最为广泛接受的机制是具有激活作用的小分子RNA转染细胞后，首先被装载于Ago蛋白家族，形成有活性的Ago-RNA复合物，该复合物穿过核膜，特异性结合于靶基因启动子区域，招募多种组蛋白修饰酶，染色质结构打开，转录激活[10]。近年的研究表明，越来越多的miRNA可通过作用于基因启动子区域，激活特定基因表达[11]。miRNAs激活作用出现在转染后的24～48 h，在72 h达高峰，作用约可持续2周[12]。

miR-3619-5p是近年新发现的可抑制肿瘤生长的miRNA，目前在肿瘤中的研究较少。Niu等[5]研究发现，非小细胞肺癌中miR-3619-5p表达水平显著降低，β-链蛋白表达升高，两者表达水平呈明显的负相关。生物信息学分析显示，miR-3619-5p可结合非小细胞肺癌细胞中β-链蛋白mRNA的3′-UTR以抑制其翻译，显著抑制癌细胞的生长和侵袭作用，有望成为非小细胞肺癌新型的抑癌因子。miR-3619-5p不仅具有干扰基因的表达，而且具有激活基因表达的作用。Li等[6]研究发现，miR-3619-5p可通过激活前列腺癌细胞中p21基因的表达，抑制前列腺癌细胞的生长和迁移。然而，miR-3619-5p在乳腺癌细胞中的作用未见报道。本组发现，转染miR-3619-5p后乳腺癌细胞的增殖能力明显下降，细胞周期明显受到抑制，细胞凋亡率明显升高。CDK6和Cyclin D1是细胞周期相关蛋白，两者可特异性结合形成CyClin D1-CDK6复合物，促进细胞周期的进展，提高细胞的增殖能力，参与多种肿瘤的发生、发展[13-14]。通过qRT-PCR和Western blot检测发现，CDK6和Cyclin D1的表达水平均明显下降。p21基因在多种肿瘤中呈显著的低表达，具有广泛的细胞周期依赖性激酶抑制活性，可特异性的抑制Cyclin D1-CDK6复合物的形成，抑制肿瘤的生长，具有明显的抑癌效应[15-16]。我们通过qRT-PCR和Western blot实验发现miR-3619-5p可明显激活乳腺癌细胞中p21蛋白的表达。乳腺癌中p21蛋白表达升高导致CDK6和Cyclin D1的表达明显下调，使Cyclin D1-CDK6复合物形成减少，导致MCF-7和T47D细胞G1期到S期进程受阻，乳腺癌细胞周期的进展受到抑制，增殖能力下降。miR-3619-5p是否直接通过作用于p21基因启动子区域激活表达是本实验分析不足，我们下一步将采用染色质免疫共沉淀实验验证miR-3619-5p的靶点。同时我们也将通过动物实验观察miR-3619-5p在体内对乳腺癌细胞增殖能力的抑制作用，并通过RNAi观察下调p21基因的表达，miR-3619-5p对乳腺癌细胞生长的影响。

综上所述，miR-3619-5p可显著抑制乳腺癌细胞的增殖能力，促进细胞的凋亡，其分子机制可能为通过激活乳腺癌细胞中抑癌基因p21的表达。miR-3619-5p有望成为具有乳腺癌治疗应用价值的基因工具。

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