孙华伟，卢凤英，张敬峰，张晓曦，徐 凯，刘传敏，张小飞

（江苏省农业科学院兽医研究所，农业部兽用生物制品工程技术重点实验室，江苏省农科院动物疫病诊断检测中心，江苏 南京 210014）

影子病在人医领域研究较多，在兽医领域研究少之又少。何谓影子病？指的是感染某种疾病后，患另一种疾病的风险明显增高，后一种疾病如同前一种疾病的影子，医学专家形象地称之为影子病[1]。为什么会有影子病？因为身体是一个有机整体，各系统相互关联和影响，使得一些看似不相关的疾病常常互为“影子”。副猪嗜血杆菌(HPS)常被称为猪蓝耳病(PRRS)的影子病[2]，但极少有文献报道两者之间相关性的确切数据。遂对江苏省农科院动物疫病诊断检测中心2017年5-8月份临床接诊的32份猪样品同时进行PRRSv与HPS的检测。具体报告如下：

1 材料

1.1 检测地点与检测时间

PRRSV的PCR检测和HPS的检测于2017年8月在江苏省农科院兽医所动物疫病诊断检测中心实验室进行。

1.2 主要试剂及仪器

PCR 仪（Applide Biosystems）购自ABI公司；Tanon凝胶成像系统（2500）购自上海天能公司；电泳仪（cavoy）购自凯元信瑞仪器公司；冷冻离心机型号为Centrifuge5424R，产自德国；生化培养箱购自上海新苗医疗器械制造有限公司；生物安全柜购自苏净集团保护气氛有限公司；胰蛋白大豆琼脂（TSA）和胰蛋白大豆肉汤（TSB）培养基购买美国BD公司；NAD（氧化型辅酶Ⅰ）购自南京奥多福尼生物科技有限公司；新生小牛血清，购自上海语纯生物科技有限公司；其他化学试剂为进口产品或国产分析纯产品；各种规格移液器，购自德国Eppendorf公司。

1.3 检测试剂盒

核酸提取及PCR试剂盒；Axy-Prep体液病毒DNA小量试剂盒购自康宁公司；PCR试剂盒等购自上海Sangon公司。

1.4 引物

1.4.1 PRRSV引物

参照相关文献设计引物，引物由南京思普金生物科技有限公司合成，该对引物的扩增目的片段大小为372 bp，见表1。

1.4.2 HPS引物

参照相关文献设计引物，引物由南京思普金生物科技有限公司合成，该对引物的扩增目的片段大小为822 bp，见表2。

2 方法

2.1 样品PRRSV的检测

待检样品PRRSV核酸的提取及PCR过程严格按照Sangon公司的试剂盒说明书进行相关操作。

2.2 样品HPS的检测

TSA平板、TSB肉汤配制时，分别添加烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）终浓度为10 mg/L和犊牛血清（终浓度50 mL/L）。烧灼剪刀、接种环，无菌采集现场剖杀的新鲜猪肺脏、心血接种涂抹于TSA平板中，置于37 ℃恒温培养箱中培养24 h。观察平板，挑取表面光滑、边缘圆滑、针尖大小成露珠样的单个菌落进一步纯化。将疑似的单个菌落进行涂片、固定、染色，油镜下观察。对分离菌株进行DNA提取，PCR反应产物经琼脂糖凝胶电泳；用胶回收试剂盒回收阳性PCR产物进行测序、比对分析。

3 结果与分析

3.1 样品PRRSV的PCR检测结果

共检测临床样品32份，其中检出PRRSV阳性样品12份，检测样品的PRRSV病原阳性率为37.5%；部分样品的电泳图见图1。

表1 PRRSV引物序列信息

表2 HPS引物序列信息

图1 部分样品PRRSV PCR 扩增结果

3.2 HPS检测结果

3.2.1 HPS的菌落形态

见图2和图3。

图2 HPS在TSA培养基上培养24 h的菌落形态

图3 HPS在TSA培养基上培养24 h的菌落形态

HPS在TSA 平板上生长缓慢，培养24 h 后，生长出边缘整齐、光滑、透明的针尖大小的菌落，菌落直径约0.3～1.2 mm。

3.2.2 HPS的细菌形态

见图4和图5。

图4 HPS革兰氏染色后的细菌形态

图5 HPS革兰氏染色后的细菌形态

取上述经纯化的菌落涂片，革兰染色后在显微镜下观察，见革兰阴性杆菌，具有多种形态，从短杆状、细长杆状到细长丝状不等，多数细菌形态为略微弯曲杆状。

3.2.3 分 离 菌 株 16SrRNAPCR检测

见图6。

图6 分离菌株 16S rRNA PCR 扩增结果

在凝胶成像系统中观察，分离菌株经PCR检测扩增出大小为822 bp的特异性条带，与预期结果一致(图6)。用胶回收试剂盒回收阳性PCR产物进行测序（测序结果未列出），并在NCBI数据库应用在线软件Nucleotide Blast进行比对分析。发现与本实验测序序列同源性最高的10个序列均为NCBI数据库已发布的HPS 16SrRNA基因序列，其同源性都在98%以上，可判定为HPS。

4 讨论

HPS和PRRS常常以混合感染或继发感染的形式发生[3]，为什么HPS被称为PRRS的影子病，而不是猪链球菌、猪传染性胸膜放线杆菌等别的细菌？说明猪群感染PRRS以后，感染HPS的几率更大，本次检测也验证了这一点，本次检测的32份样品共分离到3例猪链球菌，未分离到猪传染性胸膜放线杆菌，猪链球菌和猪传染性胸膜放线杆菌的检出率明显低于HPS。人类医学研究显示： “影子病”的发生有两大原因：一是一种疾病导致的损伤引发了第二种疾病；二是有缺陷的基因触发了另一种疾病。猪群感染PRRS以后很容易继发感染HPS的分子生物学机制还有待于进一步研究。

目前HPS的临床发病率远远高于分离率，原因在于HPS体外培养营养要求较高[4]，培养基中需要加入NAD（氧化型辅酶Ⅰ）[5]和牛血清；且HPS抵抗力不强，在体外很容易死亡，分离时，病料必须是新鲜的组织，不能冻存，采集的病料在冷藏条件下不能超过1周[6]；细菌分离鉴定时应当采集处于病急性期的猪并且没有使用抗生素的病料[7]，否则分离率大大降低。

目前防治副猪嗜血杆菌病的主要方法是抗生素的应用及灭活疫苗的使用。但随着抗生素的长期使用，HPS的耐药性越来越强，药物治疗对副猪嗜血杆菌病的防治已愈发困难，HPS发病严重的猪场，使用疫苗来预防是可选方案[8]。

[1] 兰晓雁.健康关键词：影子病[J].健康生活，2016（1）：11-12.

[2] 叶飞，贺云霞，徐慧，等.副猪嗜血杆菌病研究进展 [J]. 动物医学研究进展，2011，32（2）101-104.

[3] MACLNNES J I，GOTTSCHALK M，LONE A G，et al. Prevalence of Actinobacillus pleuropneumoniae，Actinoba-cillus，Haemophilus parasuis，Pasteurella multocida，and Streptococcus suis inrepresentative Ontario swine herds [J] .Can J Vet Res，2008，72(3)：242-248.

[4] 李曦婷，王超，薛彦杰，等.一例副猪嗜血杆菌的分离鉴定及16SrRNA生物信息学分析[J] .沈阳农业大学学报，2016，47（4）：438-444.

[5] KIELSTEINA P， WUTHEB H H，ANGENC O.Phenotypic and genet-ic characterization of NAD dependent Pasteurella ceae from the respiratory tract of pigs and their possible pathogenetic importance [J].Vet Microbiol，2001，81：243-255.

[6] 王建，邵卫星，吕占军，等.2012年我国部分省市规模化猪场副猪嗜血杆菌分离鉴定及菌株血清分型[J].动物医学进展，2014，35（3）：48-52.

[7] 魏凤，张文通，李峰，等.副猪嗜血杆菌病实验室诊断方法综述[J].猪业科学，2017.34（5）：54-55.

[8] 易新健，王小波，高清清，等.苏皖地区副猪嗜血杆菌的分离鉴定与三价灭活疫苗的初步研制[J].中国兽医学报，2017.37（5）：823-827.