时伟程

【摘 要】随着社会的进步和人们对美好社会需求的不断提高，基因编辑技术迅速发展，被广泛应用于生命科学领域。本文对基因编辑的三大技术方法进行简要介绍，同时对其在畜牧育种中的研究进行综述，并对未来基因编辑技术进行展望，以期为进一步研究基因编辑技术提供理论依据。

【关键词】基因编辑技术；畜牧育种

基因编辑（Gene Editing）技术是指一种对目的基因或转录产物进行插入、敲除和定点突变等定点精确修饰的生物技术。该技术主要利用人工核酸酶实现对基因组上特定DNA片段的敲除、敲入或修饰。目前主要有三大基因编辑技术，锌指核酸酶（ZFNs）技术，类转录激活因子效应物核酸酶（TALEN）技术和CRISPR/Cas9技术。近年来，这三大技术在畜牧育种中应用广泛，在动物性状改良方面起到了巨大作用。

一、锌指核酸酶（ZFNs）技术

锌指核酸酶（zinc finger nucleases， ZFNs）是第一代人工核酸内切酶，由锌指蛋白（zinc finger proteins， ZFPs）的DNA识别结构与非特异性 FokI 核酸内切酶融合而成。ZFPs组成的 DNA 识别域包含至少三个Cys2His2锌指蛋白可与目的基因位点结合，而FokI 是一种核酸内切酶发挥“剪刀”的功能，对目的基因进行剪切，由此达到基因编辑的。ZFPs 作为一类特殊的转录调控因子，在生物体的细胞分化、胚胎发育以及基因表达调控等多个方面发挥重要作用。

在动物活体细胞中，Bibikova等首次利用ZFN技术在非洲爪蟾卵母细胞中实现了基因打靶，从此， ZFNs技术开始被广泛应用于多种哺乳动物的基因编辑中。2011年，Hauschild 等将 ZFNs基因组编辑技术应用于猪，利用基因打靶获得了α-1，3-半乳糖基因敲除猪，为器官移植技术提供了新的思路。Whyte等将体细胞核移植技术与ZFNs技术相结合，从而获得转基因猪。2013年，Marron等利用ZFN技术成功在猪上敲除了MSTN基因，使得猪肌肉生长抑制素的形成被破坏，从而使得猪的瘦肉率得到显著提高。Cui等在2015年利用ZFNs技术在猪上得到新的突破，获得了具有生长激素受体的转基因猪， 使得研究人类疾病有了理想的新动物模型。ZFNs技术研究在牛上研究同样广泛，2011年Yu 等利用ZFNs 技术，获得了具有更高牛奶营养品质的转基因牛，他们敲除了β-乳球蛋白基因，该基因在牛奶中具有致敏性。

ZFNs技术由于发现时间较早，研究广泛，试验技术虽相对完善，但脱靶现象严重，细胞毒性大等缺点使其进一步推广应用受到严重制约。

二、类转录激活因子效应物核酸酶（TALEN）技术

转录激活因子效应物（transcription activator-like effector， TALE）和 FokI 连接构成了TALEN 结构。在ZFNs技术之后，TALEN是第二个被广泛认可的基因编辑技术。TALEN技术在应用时，首先要设计TALE的识别单元，TALE的DNA识别域由多个重复氨基酸模块组成，这些氨基酸序列十分保守。紧接着将识别单元与FokI相结合，构建TALEN质粒。TALEN技术的剪切机制是依靠TALE 特异性结合到靶位点上，其切割域形成特异性的二聚体，可使识别位点间的目标基因核苷酸实现断裂，从而完成目的基因编辑。目前构建TALEN 的方法主要有：TALEs“黄金大门”克隆法；迭代帽组装法；固相高通量自动连接技术；非连接酶依赖型克隆法等。

TALEN基因编辑技术被广泛应用于多种饲养动物中，2012年Carlson 等利用TALEN 技术敲除了猪细胞中多个基因，为 TALEN 技术在转基因猪上的广泛应用提供了研究思路。2013年， Xin等又利用该技术将猪的GGTA1基因成功进行定点敲除。2014年，Li等在猪上发现了ROSA26 基因位点，并成功利用 TALEN 技术进行定点敲入。2015年，Wu等利用 TALE技术成功在牛的常染色体中敲入小鼠的 SP110 基因，从而得到了23 头可抵抗牛结核分枝杆菌的转基因牛。同年在转基因羊的研究上，Cui 等利用TALEN技术将人乳铁蛋白敲入羊的常染色体使其替代了羊自身的β乳球蛋白，从而使得羊奶的营养价值得到了显著提高。

TALEN技术相较于ZFNs技术，其优势在于可以定点识别目标基因，从而使得基因剪切编辑更加准确高效，同时与ZFNs技术相比它的脱靶效应以及细胞毒性都得到了有效改善。

三、CRISPR/Cas9技术

CRISPR/Cas9技术是一种由RNA介导的基因编辑技术，该项技术的兴起引发了基因编辑领域新的革命。CRISPR是从对真菌和古菌宿主的研究中衍生而来的，1987年日本的Ishino等，在大肠杆菌的DNA中发现有串联间隔重复序列的特殊结构交替出现。一直到2012年，这种重复序列才被命名为规律性聚簇间隔短回文重复即CRISPR。CRISPR系统可分为三大类型： I型、II型和III型，CRISPR/Cas9便属于II型，II型系统相较于其他类型，结构较简单， 只需要一个Cas9蛋白来识别目的基因序列。现在最简便且应用最广泛的CRISPR/Cas9 技术是将利用sgRNA引导Cas9 蛋白识别特定基因序列的PAM区，造成双链 DNA 断裂，并启动 DNA 损伤修复机制。

目前CRISPR/Cas9技术在畜牧生产中被广泛应用。2014年，Hai等利用CRISPR/Cas9技术编辑猪的vWF基因，从而为治疗血管性血友病提供了新的研究模型。2015年，水牛 BMP15 和 GDF9 基因被CRISPR/Cas9 技术进行编辑，从而加快了水牛繁殖性能的提高。2016年， Han等使用CRISPR/Cas9技术敲除了猪的Hoxc13基因， 从而为人类治疗外胚层发育不良提供了模型。2016年，在我国新疆，利用CRISPR/Cas9技术成功培育出具有不同毛色的转基因绵羊。2017年，Gao 等首次将NRAMP1基因利用CRISPR/Cas9技术敲入奶牛的基因组中，成功获得了转基因奶牛共11头，经研究发现，11头奶牛均未发生脱靶效应，说明CRISPR/Cas9技术可使基因编辑脱靶效应降低，从而为进一步研究轉基因家畜提供理论基础。此外，CRISPR/Cas9技术在小鼠细胞、恒河猴、食蟹猴、小鼠和人上均有相关研究报道。

CRISPR/Cas9技術与TALEN技术和ZFNs技术相比， 其切割效率相对较高且操作简单。同时，能够更为精确且高效的对目标基因进行定点编辑，并且同时进行多位点的编辑。CRISPR/Cas9 技术目前还具有一定的局限性，其受到 PAM 元件的制约，不能完全识别特异性的DNA序列。

四、展望

基因编辑技术被认为是一种理想的基因操作手段，至今已达到一定的高度，具有效率高、定向编辑准确性高、适应性广等优点。随着科学的快速发展，基因编辑技术必将不断完善，通过敲除和敲入等手段获得家畜优良的生产性状，加快我国畜牧业发展的速度，从而为改善国民生活做出贡献，此外也可利用基因编辑技术，建立动物研究模型，使其在生命科学和医学方面更好的为人类服务。此外，基因编辑技术还存在脱靶率高、特异性以及效率低等问题，更加有效的利用基因编辑技术还有待进一步研究。随着科学的发展，各种各样的基因编辑工具不断更新，使得人们对基因编辑的研究也更加深入，不过想要真正将其应用于畜牧育种中，还需科技工作者继续努力。

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