周 凤,陈心雨,费颖颖,韩 京

(江苏师范大学化学与材料科学学院,徐州 221116)

糖尿病，尤其是2型糖尿病是继肿瘤、心血管疾病之后的第三大严重威胁人类健康的慢性非传染性疾病[1-3]。目前,全球约有2亿糖尿病患者,预计到2030年将增加至3.6亿,其中2型糖尿病约占糖尿病患者总人数的90%以上[4]。现有的一些口服降糖药物是目前治疗糖尿病的主要药物。但口服降糖药物最大的不足是无法逆转糖尿病的病因,即“治标不治本”,对于胰岛β-细胞的生长、分化和增殖无明显作用[5-7]。

胰高血糖素样肽-1(Glucagon-like peptide-1,GLP-1)是葡萄糖依赖性地促胰岛素分泌肠降血糖多肽激素,能安全降血糖,还可以保护、修复、分化、增殖胰腺β-细胞,同时还具有抑制食欲和胃酸分泌、延迟胃排空等生理作用。虽然GLP-1降血糖的优点突出,但是天然GLP-1半衰期过短的缺陷使其无法在临床应用。GLP-1在体内会被二肽基肽酶IV(DPPIV)快速水解。GLP-1在体内还会被中性内切酶(NEP 24.11)识别并降解及被肾脏快速清除,其半衰期仅为2 min左右[8-10]。

目前GLP-1受体激动剂类药物的研究都是基于天然GLP-1和Exendin-4进行结构修饰,这限制了新型GLP-1受体激动剂的研发[11]。本文以前期研究发现的非洲爪蟾GLP-1(XenGLP-1)作为先导多肽[12],先在XenGLP-1的C端引入促螺旋序列PSSGAPPPS以增加XenGLP-1的降糖活性。同时,为了定点、定量地实现XenGLP-1的PEG化,对其进行半胱氨酸定点替换,从而在肽链上引入巯基,设计了ZF-1和ZF-2 2条多肽。进一步利用MAL-PEG2 000通过半胱氨酸的巯基与设计了ZF-1和ZF-2 2条多肽相缀合,得到PEG化的PEG2 000-ZF-1和PEG2 000-ZF-2 2个缀合肽,并对缀合肽进行长效降糖活性研究。

1 仪器与材料

1.1仪器 SI Model 200型多肽合成仪(美国多肽科技有限公司)；Agilent 1260高效液相色谱仪(美国Agilent公司)；汉邦制备液相色谱仪(江苏汉邦科技有限公司)；ThermoHypersil Gold C18制备柱(250 mm×20 mm,12 μm)；真空冷冻干燥机(Labconco公司)；Ultimate 3000 analytical 液质联用质谱仪(美国Thermo公司)；ME104E型万分之一天平(美国Mettler-Toledo公司)；BT25S型十万分之一天平(德国Sartorius集团)；血糖仪与试纸(中国三诺生物传感股份有限公司)。

1.2试药 xendin-4(吉尔生化公司,批号 P141017-LR052143)；MAL-PEG2 000(西安瑞禧生物科技有限公司,批号RM2016011)；Rink Amide MBHA 树脂、Fmoc保护氨基酸、1-羟基-苯并三氮唑(HOBt)、N,N-二异丙基碳二亚胺(DIC)、苯甲硫醚(thioanisole)和二巯基乙烷(EDT),均购自上海吉尔生化有限公司(批号GLS160405-36607)；哌啶、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、三氟乙酸(TFA)为重蒸试剂,苯酚(批号20150604)、茚三酮(批号20150520)等其他试剂均为国产分析纯。茚三酮检测试剂：A.体积分数为5%的茚三酮-无水乙醇溶液；B.体积分数为80%的苯酚-无水乙醇溶液。

1.3动物 清洁级ICR小鼠：7周龄,体质量为18～22 g,雄性[上海杰斯捷实验动物有限公司,动物许可证号SCXK(沪)2013-0006]；清洁级db/db小鼠：7周龄,雄性[南京大学模式动物研究所,动物许可证号SCXK(苏)2015-0001]。

2 方法和结果

2.1ZF-1和ZF-2多肽的合成 称取 Rink Amide MBHA 树脂(担载量0.382 mmol·g-1)0.262 g(0.1 mmol),用二氯甲烷和甲醇(7 mL)交替清洗树脂1次,用7 mL二氯甲烷清洗树脂2次,加入10 mL二氯甲烷溶胀树脂1 h。将溶胀后的树脂移入多肽合成仪,以体积分数为20%的哌啶/DMF作为脱保护试剂,脱除Rink树脂的Fmoc保护基。茚三酮检测脱保护完全后,按照设计的类似物ZF-1和ZF-2的氨基酸序列,从C 端到N 端依次耦合,缩合试剂为DIC/HOBt(0.4 mmol/0.44 mmol)的DMF溶液,反应时间为2 h,采用茚三酮试剂检测缩合和Fmoc脱保护的完全程度。多肽合成完毕后,用7 mL甲醇清洗树脂3次,用氮气吹干树脂。使用切割剂Reagent R(TFA/苯甲硫醚/苯酚/EDT,90∶5∶3∶2)5 mL切割树脂,室温磁力搅拌切割2 h,过滤除去树脂,切割液经冰乙醚沉淀,洗涤后得粗肽。

表1F-1和ZF-2序列

Tab.1 ZF-1 and ZF-2 sequences

化合物长度序列ZF-139肽HGEGTYTNDVTEYLCEKAAKEFIEWLIKGKPSSGAPPPSZF-239肽HGEGTYTNDVTEYLEEKAAKEFIEWLIKGCPSSGAPPPS

2.2ZF-1和ZF-2多肽的分析和纯化

2.2.1分析方法 将目标多肽粗品溶于少量的水中,制成质量浓度为1 mg·mL-1的溶液,用0.25 μm微孔滤膜过滤,Agilent 1260高效液相色谱仪分析纯度。色谱柱：Thermo Hypersil Gold C18反相分析柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)。流动相A：体积分数0.1% TFA/水,流动相B：甲醇,梯度洗脱(0～10 min,B 50%～90%;10～15 min,B 90%～90%)。检测波长：214 nm；流速：1 mL·min-1；柱温：25 ℃；进样量：20 μL。

2.2.2制备液相纯化 制备纯化条件：色谱柱：Thermo Hypersil Gold C18反相制备柱(250 mm×20 mm,12 μm)；流速：10 mL·min-1；样品质量浓度：20 mg·mL-1；检测波长：214 nm。流动相A：体积分数0.1% TFA/水,流动相B：甲醇,梯度洗脱(0～20 min,B 55%～90%;20～45 min,B 90%～90%)。收集主峰,合并质量分数大于95%的样品,30 ℃减压蒸馏除去甲醇,真空冷冻干燥后称质量,将冷冻干燥后的纯品贮存在-20 ℃冰箱中。

2.3质谱鉴定 Timate 3000 analytical 液质联用质谱仪；使用体积分数为50%的甲醇/水溶解后进样,锥孔电压：50 V,毛细管电压：3 910 V,N2流速：648 L·h-1,锥孔温度：120 ℃,雾化室温度：330 ℃。ZF-1和ZF-2纯化后,通过质谱鉴定其相对分子质量,结果见图1和表2。

表2ZF-1和ZF-2的质谱分析

Tab.2 Mass spectrometric analysis of ZF-1 and ZF-2

化合物相对分子质量多电荷相对分子质量计算值实测值ZF-14251.81418.2[M+3H]3+1418.7[M+3H]3+1064.0[M+4H]4+1064.3[M+4H]4+ZF-24252.71418.6[M+3H]3+1418.9[M+3H]3+1064.2[M+4H]4+1064.4[M+4H]4+

图1ZF-1和ZF-2的质谱图

Fig.1 Mass spectrogram of ZF-1 and ZF-2

2.4PEG2 000-ZF-1和PEG2 000-ZF-2缀合肽的合成 利用巯基和马来酰亚胺可以快速、定点、定量的反应特征,在中性条件下,将ZF-1和ZF-2与MAL-PEG2 000缀合,得到PEG化的ZF-1和ZF-2缀合肽[13]。反应条件：将ZF-1和ZF-2与MAL-PEG2 000在pH值为7的条件下,以体积分数为50%的水/甲醇做溶剂,在DIEA的催化下反应0.5 h。使用安捷伦 HPLC监测反应进程,反应完全后,利用制备液相分离纯化得到目标缀合肽,合成路线见图2,PEG2 000-ZF-1和PEG2 000-ZF-2缀合肽的结构见图3。

2.5EG2 000-ZF-1和PEG2 000-ZF-2缀合肽的结构鉴定 ltimate 3 000 analytical 液质联用质谱仪；使用体积分数为50%的甲醇/水溶解后进样,锥孔电压：70 V,毛细管电压：3 910 V,N2流速：648 L·h-1,锥孔温度：120 ℃,雾化室温度：330 ℃。通过质谱鉴定其相对分子质量,由于本研究中选择的MAL-PEG2 000是平均相对分子质量为2 000的聚合物,PEG修饰后的化合物无法计算单个分子的相对分子质量,以质谱只能测定一组相差特定质荷比的呈正态分布的多电荷离子峰。图3～4显示的是一系列呈正态分布的多电荷离子峰,PEG2 000-ZF-1和PEG2 000-ZF-2的相对分子质量理论值为4 477.9±44n及4 478.8±44n(n代表在单个分子中“CH2CH2O”骨架的数量),通过计算其理论分子离子峰值,结果显示与实测值一致。测定结果显示，最终PEG2 000-ZF-1和PEG2 000-ZF-2的相对分子质量平均值为6 325.9和6 326.8(n=42)。PEG2 000-ZF-1和PEG2 000-ZF-2缀合肽的质谱数据见图4和表3～4。

图2PEG2 000-ZF-1和PEG2 000-ZF-2缀合肽的合成路线

Fig.2 The synthetic routes of the conjugated peptides of PEG2 000-ZF-1 and PEG2 000-ZF-2

图3PEG2 000-ZF-1和PEG2 000-ZF-2缀合肽的结构

Fig.3 The structures of the conjugated peptides of PEG2 000-ZF-1 and PEG2 000-ZF-2

图4PEG2 000-ZF-1andPEG2 000-ZF-2的质谱图

Fig.4 The mass spectrogram of PEG2 000-ZF-1 and PEG2 000-ZF-2

表3PEG2 000-ZF-1的质谱分析结果

Tab.3 The results of mass spectrometric analysis of PEG2 000-ZF-1

na(m/z)计算值(m/z)实测值40[m+5H]5+1248.6[M+4H+Na]5+1253.0[m+5H]5+1248.8[M+4H+Na]5+1253.441[m+5H]5+1257.4[M+4H+Na]5+1261.8[m+5H]5+1256.9[M+4H+Na]5+1262.142[m+5H]5+1266.2[M+4H+Na]5+1270.6[m+5H]5+1266.3[M+4H+Na]5+1270.843[m+5H]5+1275.0[M+4H+Na]5+1279.4[m+5H]5+1274.8[M+4H+Na]5+1279.744[m+5H]5+1283.8[M+4H+Na]5+1288.2[m+5H]5+1283.5[M+4H+Na]5+1288.5

表4EG2 000-ZF-2的质谱分析结果

Tab.4 The results of mass spectrometric analysis of PEG2 000-ZF-2

na(m/z)计算值(m/z)实测值40[m+5H]5+1248.8[M+4H+Na]5+1253.2[m+5H]5+1249.2[M+4H+Na]5+1253.541[m+5H]5+1257.6[M+4H+Na]5+1262.0[m+5H]5+1257.8[M+4H+Na]5+1262.342[m+5H]5+1266.4[M+4H+Na]5+1270.8[m+5H]5+1266.7[M+4H+Na]5+1271.343[m+5H]5+1275.2[M+4H+Na]5+1279.6[m+5H]5+1275.8[M+4H+Na]5+1279.944[m+5H]5+1284.0[M+4H+Na]5+1288.4[m+5H]5+1284.3[M+4H+Na]5+1289.2

2.6生物活性的测定

2.6.1PEG2 000-ZF-1、PEG2 000-ZF-2缀合肽的短效降糖活性测试 小鼠腹腔糖耐量实验是通过给予小鼠葡萄糖和受试化合物,依据空白组对照,测定不同时间的血糖水平,可以准确评估化合物的短效降血糖活性[14-15]。使用ICR小鼠来评价缀合肽的降糖活性,实验方法：雄性ICR小鼠(体质量18～22 g),适应性饲养1周后,实验前随机分组,每组6只。自由饮水,禁食过夜(12 h)。在腹腔给予葡萄糖前10 min每组ICR小鼠分别腹腔注射生理盐水(空白对照)、阳性对照GLP-1(25 nmol·kg-1)、受试化合物PEG2 000-ZF-1、PEG2 000-ZF-2(25 nmol·kg-1)；0 min腹腔注射葡萄糖(2 g·kg-1),于0,15,30,60和120 min在小鼠尾部断尾取血，用血糖仪测定血糖值。见图5。

由图5可知,PEG2 000-ZF-1和PEG2 000-ZF-2缀合肽均有显著的降糖活性,在15和30 min时的血糖数值与阳性对照GLP-1相当,说明PEG化缀合肽并没有PEG的降糖活性。

图5PEG2 000-ZF-1和PEG2 000-ZF-2的短效血糖时间曲线

Tab.5 Short-acting blood glucose and time curves of PEG2 000-ZF-1 and PEG2 000-ZF-2

2.6.2PEG2 000-ZF-1、PEG2 000-ZF-2缀合肽的长效降糖活性测试 db/db小鼠是一种2型糖尿病稳定可靠的动物模型,其正常血糖值基本在15 mmol·L-1以上,而正常小鼠的血糖值低于10 mmol·L-1,基于db/db小鼠的高血糖特点,设计db/db小鼠不禁食给药降糖实验[16-18]。db/db小鼠在腹腔注射PEG2 000-ZF-1和PEG2 000-ZF-2缀合肽后,自由饮食饮水,对照组db/db小鼠的血糖值会维持在高位,而注射缀合肽小鼠的血糖值会先下降,后随着药效的降低血糖值会缓慢回升。因此,通过比较化合物降低血糖的曲线及曲线下面积,可以准确评估化合物的长效降糖活性[19-20]。

6周龄雄性db/db小鼠,随机分组,每组6只,适应性饲养(标准小鼠饲料,12 h光照,25 ℃)1周后,使用血糖仪测定各组小鼠的血糖数值,待各组小鼠血糖值高于15 mmol·L-1后开始实验。阳性对照组给予exendin-4(25 nmol·kg-1)、化合物组给予PEG2 000-ZF-1、PEG2 000-ZF-2(25 nmol·kg-1),阴性对照组给予生理盐水。0 h给予各组化合物及生理盐水,各组小鼠自由饮水、饮食,于0,1,2,3,4,6,8,10,12,16,20和24 h在小鼠尾部断尾取血,用血糖仪测定血糖,作血糖曲线,并计算曲线下面积。见图6～7。

由图6～7可知,PEG2 000-ZF-1和PEG2 000-ZF-2缀合肽在25 nmol·kg-1的剂量下,稳定血糖作用都优于阳性对照exendin-4。它们的血糖曲线下面积也显著小于exendin-4,这说明PEG2 000-ZF-1和PEG2 000-ZF-2缀合肽不仅具有优异的降糖活性,其长效降糖作用也非常显著,具有潜在的药物开发前景。

图6PEG2 000-ZF-1和PEG2 000-ZF-2的长效血糖时间曲线

Tab.6 Long-acting blood glucose and time curves of PEG2 000-ZF-1 and PEG2 000-ZF-2

图7PEG2 000-ZF-1、PEG2 000-ZF-2的血糖曲线下面积

Tab.7 The area under the blood glucose curves of PEG2 000-ZF-1 and PEG2 000-ZF-2

3 小结

随着生活水平的提高,糖尿病患者逐年递增,因此,对于糖尿病治疗药物的研究具有重大意义。本研究将与人GLP-1具有相似生物活性的XenGLP-1作为先导多肽,先在XenGLP-1的C端引入增加活性的片段及Cys定点替换,再进行PEG长效化修饰,这既实现了PEG与XenGLP-1多肽定点、定量的缀合,又减轻了PEG化所导致的XenGLP-1多肽降糖活性的降低程度。

分别在ICR鼠和2型糖尿病db/db模型小鼠上评价了缀合肽的短效及长效降糖活性。活性实验结果表明,PEG2 000-ZF-1、PEG2 000-ZF-2缀合肽不仅具有优异的降糖活性,也具有良好的长效降糖作用,值得进行深入的活性研究,具有开发成2型糖尿病治疗药物的前景。

[1] American Diabetes Association.Diagnosis and Classification of Diabetes Mellitus[J].Diabetes Care,2014,37 (Supple 1)：S81-S90.

[2] 周琦,刘一辉.糖尿病研究及其防治[J].现代医药卫生,2013,29(4)：560-562.

[3] 姚立群,张敏,林朝芹,等.糖尿病连续性护理的研究进展[J].中华护理杂志,2012,47(6)：568-570.

[4] 张玉省,黄丽琴,王芳,等.口服二甲双胍血糖控制不佳的2型糖尿病患者联合沙格列汀治疗的效果与安全性研究[J].河北医科大学学报,2017,38(4)：458-461.

[5] 张玉领,孙长颢.Ⅱ型糖尿病动物模型的研究进展[J].现代预防医学,2012,39(8)：2015-2017.

[6] E N Murage,G Gao,A Bisello,et al.Development of potent glucagon-like peptide-1 agonists with high enzyme stability via introduction of multiple lactam bridges[J].J Med Chem,2010,53(17)：6412-6420.

[7] B Manandhar,J M Ahn.Glucagon-like peptide-1 (GLP-1) analogs:recent advances,new possibilities,and therapeutic implications[J].J Med Chem,2015,58(3)：1020-1037.

[8] J Han,X Huang,L Sun,et al.Novel fatty chain-modified glucagon-like peptide-1 conjugates with enhanced stability and prolongedinvivoactivity[J].Biochem Pharmacol,2013,86(2)： 297-308.

[9] L P Miranda,K A Winters,C V Gegg,et al.Design and synthesis of conformationally constrained glucagon-like peptide-1 derivatives with increased plasma stability and prolongedinvivoactivity[J].J Med Chem,2008,51(9)：2758-2765.

[10]盖克克,段蓉,李正翔.胰高血糖素样肽-1受体激动剂和二肽基肽酶-4抑制剂联用二甲双胍治疗2型糖尿病的疗效与安全性对比的系统评价[J].中国医院药学杂志,2017,37(7)：633-638.

[11]Meier J J.GLP-1 receptor agonists for individualized treatment of type 2 diabetes mellitus[J].Nat Rev Endocrinol,2012,8 (12)：728-742.

[12]J Han,Y Wang,Q Meng,et al.Design,synthesis and biological evaluation of PEGylated Xenopus glucagon-like peptide-1 derivatives as long-acting hypoglycemic agents[J].Eur J Med Chem,2017,132：81-89.

[13]Y Chi,H Zhang,W Huang,et al.Microwave-assisted solid phase synthesis,PEGylation,and biological activity studies of glucagon-like peptide-1(7-36) amide[J].Bioorg Med Chem,2008,16(16)： 7607-7614.

[14]J Han,L Sun,Y Chu,et al.Design,Synthesis,and Biological activity of novel dicoumarol glucagon-like peptide 1 conjugates[J].J Med Chem,2013,56(24)：9955-9968.

[15]J Han,L Sun,X Huang,et al.Novel coumarin modified GLP-1 derivatives with enhanced plasma stability and prolongedinvivoglucose-lowering ability[J].Br J Pharm,2014,171(23)：5252-5264.

[16]Solini A,Rossi C,Duranti E,et al.Saxagliptin prevents vascular remodeling and oxidative stress in db/db mice.Role of endothelial nitric oxide synthase uncoupling and cyclooxygenase[J].Vasc Pharm,2016,76：62-71.

[17]X Cui,Q Meng,Y Chu,et al.Glucagon-like peptide-1 loaded phospholipid micelles for the treatment of type 2 diabetes:improved pharmacokinetic behaviours and prolonged glucose-lowering effects[J].Rsc Adv,2016,6(97)：94408-94416.

[18]C Mapelli,S I Natarajan,J P Meyer,et al.Eleven amino acid glucagon-like peptide-1 receptor agonists with antidiabetic activity[J].J Med Chem,2009,52(23)：7788-7799.

[19]S Y Chae,Y G Chun,S Lee,et al.Pharmacokinetic and pharmacodynamic evaluation of site-specific PEGylated glucagon-like peptide-1 analogs as flexible postprandial-glucose controllers[J].J Pharm Sci,2009,98(4)：1556-1567.

[20]T H Kim,H H Jiang,S Lee,et al.Mono-PEGylated dimeric exendin-4 as high receptor binding and long-acting conjugates for type 2 anti-diabetes therapeutics[J].Bioconjug Chem,2011,22(4)：625-632.