王 磊,陈施展,买尔哈巴·吐尔逊,李丽丹,刘峻甫,谢孟君,艾尼娃尔·艾克木

(1.新疆医科大学药学院,乌鲁木齐 830011；2.新疆医科大学厚博学院,克拉玛依 834000；3.新疆医科大学中医学院,乌鲁木齐 830011；4.新疆医科大学中心实验室,乌鲁木齐 830011)

在哺乳动物中,循环系统的血流压力驱动氧气到达机体各组织中。引起低氧的原因有：机体器官或组织与外界环境的氧气交换减少、血管床减少、大气环境氧分压降低和水生环境氧含量下降等情况。低氧影响机体正常的生长发育,甚至导致某些器官、组织、细胞或亚细胞水平功能障碍或损伤[1-2]。机体在低氧状态下,常常优先保障心脑等重要器官的血供,而睾丸的血供通常会显著下降,睾丸组织和细胞常常出现损伤[3]。近年来,随着生活质量的提高,长期工作和生活在高原的平原移居者生殖机能方面的改变开始备受关注。

单硝酸异山梨酯缓释片(Isosorbide-5-Mononitrate Sustained Release Tablets)通过扩张全身血管和冠状血管来改善心肌耗氧量和心脏血供,常用于治疗低氧环境下的冠心病和心绞痛[4]。本课题组发现单硝酸异山梨酯缓释片对大鼠受损睾丸具有一定的保护作用,但相关报道不多。高原低氧引起的低氧性肺动脉高压(hypoxic pulmonary hypertension,HPH)较常见,HPH是慢性高原病(chronic mountain sickness,CMS)发病的重要病理生理变化。本实验通过建立CMS大鼠模型,以HPH和睾丸相关病理切片作为CMS大鼠模型造模的指标,研究单硝酸异山梨酯缓释片对CMS大鼠的PAP、IL-6、CRP、MDA、SOD和GSH-PX等指标的影响,旨在探讨单硝酸异山梨酯缓释片对CMS大鼠模型睾丸的保护作用。

1 仪器与材料

1.1仪器 TDL80-2B离心机(上海安亭科学仪器厂)；LEICA RM 2016石蜡切片机(上海五相仪器仪表有限公司)。

1.2试药 单硝酸异山梨酯缓释片(英国Astrazeneca公司,批号1206085)；硝苯地平片(山西云鹏制药有限公司,批号C120304)；大鼠白介素-6试剂盒(美国eBioscience公司,批号74350026)；大鼠C-反应蛋白试剂盒(上海西唐生物科技有限公司,批号3400630)；大鼠超氧化物歧化酶试剂盒、大鼠丙二醛试剂盒和大鼠谷胱甘肽-过氧化氢酶试剂盒(批号：20130410,20130409,20130401),均购自南京建成生物工程研究所。

1.3动物 正常SD大鼠60只,体质量160～200 g,均为新疆医科大学动物中心提供(许可证号：SCKK(新)2011-0004)。

2 方法

2.1CMS大鼠造模 在西北地区平时和战时卫勤保障人工实验舱造模,该舱条件：模拟海拔5 000 m,压力54.1 kPa,氧分压10.84 kPa,温度范围18～26 ℃,湿度范围40%～60%。每日定时观察大鼠的摄食、饮水、毛发、粪便和行为等状况以及眼、耳、鼻、口有无分泌物,定时称定体质量。整个操作过程在30 min内完成。30 d后,进行干预。实验方案的设计及实施均由新疆医科大学第一附属医院动物伦理委员会审核批准(审批号：IACUC-20130217063)。

2.2SD大鼠肺动脉压的测定 SD大鼠采用仰卧位固定,剪开颈部、胸部外皮,随后沿着胸骨的正中线打开胸腔,暴露心脏和肺。肺动脉压力通过充满肝素化的生理盐水的针头插入肺动脉来测量,肉眼可视针头的位置。针头的另一端利用压力换能器和自制导管相连,将压力变化的数据用生物信号记录仪记录。

2.3SD大鼠睾丸病理学的检查方法 (1)SD大鼠睾丸蜡块标本的制备。取下左侧睾丸,用生理盐水清洗3次,沿睾丸纵向中部切开,去除睾丸脂肪、附着精膜及上下两侧部分组织,用100 mL·L-1甲醛固定,将上述固定的组织标本按顺序依次置于体积分数为70%的乙醇中3 h、体积分数为80%的乙醇中2 h、体积分数为90%的乙醇中1.5 h、乙醇中2 h和无水乙醇中1 h；再置于二甲苯中透明处理30 min；在低熔点石蜡中浸润3 h,使浸润标本在室温下凝固为蜡块标本。(2)SD大鼠睾丸组织切片的制备。将蜡块标本制成4 μm切片,按顺序在体积分数为30%～40%的乙醇和38 ℃的水中展开,使用载玻片捞取切片,将取到切片的载玻片放入37 ℃烘箱中12 h,室温保存。(3)组织切片常规HE染色。将石蜡切片连续3次置于二甲苯中各进行15 min脱蜡；连续2次置于无水乙醇中2 min,乙醇中2 min,体积分数为80%的乙醇中2 min和蒸馏水中冲洗；置于苏木精中染色6 min,用蒸馏水冲洗；置于1 mL·L-1盐酸乙醇液中分色数秒,用蒸馏水冲洗；置于5 mL·L-1氨水中返蓝,用蒸馏水冲洗3次；再置于伊红染液中数秒,用蒸馏水冲洗；最后依次置于体积分数为80%的乙醇中数秒,乙醇中数秒,无水乙醇中2 min脱水。在64 ℃温箱内干燥10 min,再滴加中性树胶,盖好盖玻片,晾干封固。用普通光学显微镜观察睾丸组织细胞的形态变化。

2.4SD大鼠血清学指标的测定 将实验SD大鼠随机分成6组,每组10只,其中5组进行CMS造模。造模30 d后,根据体质量进行干预。①单硝酸异山梨酯缓释片高剂量组：给予单硝酸异山梨酯缓释片3.239 8 mg,每日1次,灌胃15 d；②单硝酸异山梨酯缓释片中剂量组：给予单硝酸异山梨酯缓释片1.619 9 mg,每日1次,灌胃15 d。③单硝酸异山梨酯缓释片低剂量组：给予单硝酸异山梨酯缓释片0.809 9 mg,每日1次,灌胃15 d。④阳性对照组：给予硝苯地平2.7 mg,每日1次,连续灌胃15 d。⑤高原模型组：使用等量生理盐水灌胃,每日1次；⑥正常对照组：不采取任何干预措施且未造模。以上各组连续干预15 d后,取氯胺酮(50 mg·mL-1)、地西泮(5 mg·mL-1)和阿托品(0.5 mg·mL-1)各1支的液体混合物,稀释1倍,按照0.007 5 mL·g-1对实验SD大鼠腹腔注射麻醉,再腹主动脉采血,室温下放置30 min,用低温离心机以3 000 r·min-1离心20 min,取上清液,用相应的试剂盒测定IL-6和CRP指标。

2.5SD大鼠睾丸匀浆后指标的测定 取大鼠左侧睾丸,置于生理盐水中清洗3次,沿睾丸纵向中部切开,去除睾丸脂肪、附着精膜以及上下两侧部分组织,用天平称定质量,将所需部分移至烧杯中,向其中加入适量预冷的生理盐水,用相应器具在低温下剪碎标本,后用组织匀浆器匀浆15 min,再用低温离心机以3 500 r·min-1离心15 min,取上清液,检测SOD、MDA和GSH-PX。

2.6数据处理 使用统计软件SPSS 17.0,所有相关数据均作方差齐性检验和正态性检验,采用χ2检验和单因素方差分析。用方差分析来进行组间比较,当P<0.05时,组间比较差异具有统计学意义。

3 结果

3.1大鼠睾丸组织形态学比较 ①正常对照组：在低、高倍镜下均可见睾丸组织结构未见异常,无病变,精细胞多。②高原模型组：最明显的病变是间质充血以及血管出血,次级精母细胞水肿,体质缩小,精细胞变性,结构不清。③阳性对照组：最明显的病变是次级精母细胞肿胀变性,间质有轻度充血。④单硝酸异山梨酯缓释片低剂量组：血管扩张,精细胞较少,可见次级精母细胞肿胀。⑤单硝酸异山梨酯缓释片中剂量组：血管扩张充血,精细胞少。⑥单硝酸异山梨酯缓释片高剂量组：无充血,初级精母细胞肿胀偶见,精细胞数量有所恢复。见图1。

3.2大鼠PAP的变化 高原模型组、阳性对照组和单硝酸异山梨酯缓释片中、低剂量组与正常对照组比较,PAP有所上升,差异具有统计学意义(P<0.05)；单硝酸异山梨酯缓释片高剂量组与正常对照组比较,PAP差异无统计学意义(P>0.05)；与高原模型组比较,阳性对照组、单硝酸异山梨酯缓释片各剂量组PAP有所降低,差异有统计学意义(P<0.05)。阳性对照组和单硝酸异山梨酯缓释片高、中、低剂量组均可降低CMS大鼠的PAP。其中单硝酸异山梨酯缓释片高剂量组的改善作用最好,优于阳性对照组,其结果基本接近正常对照组的水平。见表1。

3.3大鼠睾丸血清中CRP和IL-6水平的变化 高原模型组、阳性对照组、单硝酸异山梨酯缓释片各剂量组中的CRP和IL-6与正常对照组比较均有所上升,差异具有统计学意义(P<0.05)。阳性对照组和单硝酸异山梨酯缓释片各剂量组中的CRP和IL-6与高原模型组比较有所降低,差异有统计学意义(P<0.05)。阳性对照组和单硝酸异山梨酯缓释片高、中、低剂量组均可降低CMS大鼠的CRP和IL-6水平。其中单硝酸异山梨酯缓释片高剂量组对指标CRP和IL-6的改善作用最好,优于阳性对照组。见表2。

图1大鼠睾丸组织形态学比较

A.正常对照组 (×100)；B.正常对照组 (×400)；C.高原模型组 (×100)；D.高原模型组 (×400)；E.阳性对照组 (×100)；F.阳性对照组 (×400)；G.单硝酸异山梨酯缓释片低剂量组 (×100)；H.单硝酸异山梨酯缓释片低剂量组 (×400)；I.单硝酸异山梨酯缓释片中剂量组 (×100)；J.单硝酸异山梨酯缓释片中剂量组 (×400)；K.单硝酸异山梨酯缓释片高剂量组 (×100)；L.单硝酸异山梨酯缓释片高剂量组 (×400)。

Fig.1 Comparison of morphology of testis in rats

A.blank control group (×100)；B.blank control group (×400)；C.high altitude group (×100)；D.high altitude group (×400)；E.positive control group (×100)；F.positive control group (×400)；G.low dosage Isosorbide-5-Mononitrate Sustained Release Tablets group (×100)；H.low dosage Isosorbide-5-Mononitrate Sustained Release Tablets group (×400)；I.medium dosage Isosorbide-5-Mononitrate Sustained Release Tablets group (×100)；J.medium dosage Isosorbide-5-Mononitrate Sustained Release Tablets group (×400)；K.high dosage Isosorbide-5-Mononitrate Sustained Release Tablets group (×100)；L.high dosage Isosorbide-5-Mononitrate Sustained Release Tablets group (×400).

表1各组实验大鼠肺动脉压的变化

Tab.1 Changes in the pulmonary arterial pressure of rats in each group (n=10,±s)

注：*P<0.05表示与正常对照组比较,差异具有统计学意义；▲P<0.05表示与高原模型组比较,差异具有统计学意义。

3.4单硝酸异山梨酯缓释片对大鼠睾丸匀浆中SOD、MDA和GSH-PX等指标的影响 高原模型组、阳性对照组和单硝酸异山梨酯缓释片低剂量组中的SOD水平与正常对照组比较有所下降,差异具有统计学意义(P<0.05),而单硝酸异山梨酯缓释片中、高剂量组与正常对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。与高原模型组比较,阳性对照组和单硝酸异山梨酯缓释片各剂量组的SOD水平均有所上升,差异有统计学意义(P<0.05)。其中单硝酸异山梨酯缓释片高剂量组对指标SOD的改善作用最好,优于阳性对照组。

表2大鼠血中CRP和IL-6水平的变化

Tab.2 Changes of levels of CRP and IL-6 in the sera of rats (n=10,±s)

注：*P<0.05表示与正常对照组比较,差异具有统计学意义；▲P<0.05表示与高原模型组比较,差异具有统计学意义。

与正常对照组比较,高原模型组、阳性对照组和单硝酸异山梨酯缓释片低剂量组中的MDA水平上升,差异有统计学意义(P<0.05),而单硝酸异山梨酯缓释片中、高剂量组与正常对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。与高原模型组比较,阳性对照组和单硝酸异山梨酯缓释片各剂量组的MDA水平有所下降,差异有统计学意义(P<0.05)。其中单硝酸异山梨酯缓释片高剂量组对指标MDA的改善作用最好,优于阳性对照组。

与正常对照组比较,高原模型组、阳性对照组和单硝酸异山梨酯缓释片低、中剂量组的GSH-PX水平下降,差异具有统计学意义(P<0.05),而单硝酸异山梨酯缓释片高剂量组与正常对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。与高原模型组比较,阳性对照组和单硝酸异山梨酯缓释片各剂量组的GSH-PX水平有上升,差异有统计学意义(P<0.05)。其中单硝酸异山梨酯缓释片高剂量组对指标GSH-PX的改善作用最好,优于阳性对照组。见表3。

表3各组实验大鼠匀浆中SOD、MDA和GSH-PX水平的变化

Tab.3 Changes of levels of SOD,MDA and GSH-PX in the homogenate organization in rats′ testis (n=10,±s)

注：*P<0.05表示与正常对照组比较,差异有统计学意义；▲P<0.05表示与高原模型组比较,差异有统计学意义。

4 讨论

肺血管阻力增加是HPH发病的中心环节,以肺动脉收缩反应增强和平滑肌细胞增生为主要特征的肺血管结构重建是HPH发病的主要病理变化[5]。大多数哺乳动物的阴囊温度比机体核心温度低2～7 ℃,睾丸位于阴囊内,精子产生所需的血氧供应与机体其他部位的血氧调节变化是相对独立的,因此机体能够很好地控制睾丸微环境,但若长期暴露于低氧环境,睾丸组织营养物质、血流量和氧气供应量等可能发生变化,这些变化会对睾丸功能产生不良影响,进而导致雄性生育能力低下或不育[6]。本课题研究发现,高原模型组的PAP明显高于正常对照组,且高原模型组的睾丸病理切片能显示间质充血以及血管出血,次级精母细胞水肿,体质缩小,精细胞变性,结构不清,提示CMS条件下的睾丸造模良好。

氧自由基又称活性氧族(Reactive free species,ROS),是一种具有多种生物学功能且有双重作用的介质[7-8]。正常机体都会产生许多有害的自由基,但由于机体存在强大的抗氧化防御系统,该系统可有效清除ROS及其代谢产物,在正常新陈代谢状态下,该系统能够维持机体自由基的形成和去除达到动态的平衡,因此很难监测到整个正常机体受到氧化损伤或破坏[9],这对维持生精过程有重要的意义[10-11]。机体的抗氧化能力直接受抗氧化酶活性高低的影响,抗氧化酶主要为SOD和GSH-PX等。SOD和GSH-PX对ROS的清除起重要作用[12]。SOD通过与MDA相互配合测定,机体清除氧自由基的程度可由SOD的活力大小来衡量,机体内自由基的产生状况以及受自由基的攻击程度可通过MDA的大小来判断[13]。测定GSH-PX的活力可作为衡量机体氧化应激水平的一项生化指标。研究发现,模型组的SOD和GSH-PX水平低于正常对照组,MDA水平高于正常对照组,说明模型组大鼠清除自由基能力减弱,且机体细胞受到一定程度的自由基攻击。而给予单硝酸异山梨酯缓释片高剂量组的SOD、MDA和GSH-PX水平接近正常对照组,且优于阳性对照组,说明单硝酸异山梨酯缓释片对CMS大鼠模型的睾丸组织细胞具有一定的保护作用。

核转录因子-κB(nuclearfacto-κB,NF-κB)的表达受低氧诱导,机体炎症反应的调控源于NF-κB[14]。支持细胞分泌的细胞因子IL-6一方面能在介导炎症反应及免疫调节中发挥作用,另一方面在维持和调节睾丸局部的相关环境以及机体生殖功能等方面也有着重要的生理作用[15]。CRP是一种对组织感染、损伤和坏死等刺激因素都能较快发生反应的蛋白,炎症和组织损伤程度以及相关的治疗反应等情况都可使用CRP大小来进行评估[16-19]。研究发现,与正常对照组比较,高原模型组的CRP和IL-6水平均明显上升,说明CMS大鼠的睾丸组织细胞已产生一定的炎症,而单硝酸异山梨酯缓释片高剂量组对指标CRP和IL-6的改善作用较好,接近阳性对照组,且水平值优于阳性对照组,提示单硝酸异山梨酯缓释片具有间接抗炎症反应作用。

综上所述,CMS大鼠的PAP水平升高,且睾丸病理切片出现间质充血以及血管出血,提示CMS大鼠造模成功,其睾丸受到一定程度的损伤。CMS大鼠经过单硝酸异山梨酯缓释片高剂量干预后,可有效降低CMS大鼠的PAP、CRP和IL-6水平,提高睾丸的SOD和GSH-PX水平,降低脂质过氧化产物MDA的水平,清除氧自由基,同时,睾丸病理切片亦出现相应改善。单硝酸异山梨酯缓释片对CMS大鼠模型睾丸有一定的保护作用。实验结果表明，单硝酸异山梨酯缓释片是常用的心血管类药物,本课题从睾丸研究的角度,观察和评价其相关的药理作用,实现传统药的新研究。

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