正交实验法优选金番止泻胶囊中多糖的提取工艺

2018-01-10

中国民族民间医药 2017年23期

1．广东药科大学中药学院，广东广州 510006；2．广东省中山市黄圃人民医院，广东中山 528429；3.广东药科大学医药化工学院、广东省化妆品工程技术研究中心，广东中山 528458

陈建龙1梁丽萍1赖岳晓2田素英3*

目的研究金番止泻胶囊中多糖的最佳提取工艺。方法以多糖含量为指标，用紫外分光光度法测金番止泻胶囊中多糖含量，以加水量、提取次数、提取温度、提取时间为考察因素，采用L9(34)正交实验法优选其最佳提取工艺。结果金番止泻胶囊中多糖的最佳提取工艺为A1B3C3D3，即8倍量水，提取3次，提取温度70 ℃，每次2 h。结论优选的金番止泻胶囊中多糖的提取工艺条件稳定，提取充分，方法简便可行。

金番止泻胶囊；优选工艺；紫外分光光度法；多糖

金番止泻胶囊是中山市名老中医的验方，由金樱根、番石榴叶、茯苓等组成，功可清热、补虚、止泻，临床治疗腹泻效果良好。其中的金樱根、茯苓均含丰富的多糖[1]。多糖为人体必需四大抑制病毒对细胞的吸附物质之一，具有抗变态反应，抑制病毒对细胞的吸附，可提高机体免疫力[2]。笔者以多糖为指标，以正交实验法优选金番止泻胶囊中多糖的提取工艺，为进一步开发临床新药提供科学依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器 UV1102紫外可见分光光度计(上海天美科学有限公司)；AUW220D电子天平(日本岛津)；ZF-20D暗箱式紫外分析仪(上海顾村电光仪器厂)；KQ-500型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2 材料无水葡萄糖标准品(批号：081133-201604，中国食品药品检定研究院)；金樱根(批号: 20160823)、番石榴叶(批号:20160712)购自广州致信中药饮片有限公司，茯苓(批号:20160920，广州康圣药业有限公司)，药材经广东药科大学田素英副教授鉴定均为正品。所用试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 粗多糖的含量测定

2.1.1 标准曲线的制定确定最大波长，精密称取无水葡萄糖标准品10.1 mg，置50 mL容量瓶中，加适量重蒸水溶解，以蒸馏水定容，摇匀，即得葡萄糖标准溶液(0.202 mg/mL)。取1 mL葡萄糖标准品溶液置于10 mL容量瓶中，加5%苯酚1 mL，混匀，迅速加浓硫酸5 mL，摇匀，以蒸馏水稀释至刻度，在室温状态下经全波长扫描确定葡萄糖标准品溶液最大吸收波长为490.2 nm。

绘制标准曲线，精密移取葡萄糖标准品溶液0、1、1.5、2、2.5、3 mL，各自置于10 mL容量瓶中，分别加入5%苯酚l mL，摇匀，迅速加入5 mL浓硫酸溶液，振摇5 min，定容至刻度，放置至室温。以蒸馏水做空白，按紫外分光光度法(中国药典2015版一部附录ⅤA)[3]，在490.0 nm 处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，得回归方程：y=9.1747x+0.0199，相关系数r=0.9992。线性关系考察结果表明：葡萄糖标准品溶液在0.0000～0.0606mg/mL浓度范围内具有良好的线性关系。

2.1.2 方法学考察制备供试品溶液按前期研究所得最佳组方比例[4]称取药材10 g，加水100 mL，浸泡30 min后煎煮，合并滤液，浓缩至20 mL。取浓缩液5 mL加无水乙醇至10 mL，搅拌，3000 r/min离心10 min后取沉淀用乙醇洗涤至无色，挥干乙醇后，沉淀加蒸馏水溶解并定容于100 mL量瓶中，即得供试品溶液。

2.1.3 精密度试验取葡萄糖标准品溶液1 mL置于10 mL容量瓶中稀释至刻度，按“2.1.1”项测定吸光度，平行测定6次，RSD为0.68%(n=6)，表明精密度良好。

2.1.4 稳定性试验取上述供试品溶液1 mL，按“2.1.1”方法分别于0、30、60、90、120、150、180 min测定吸收度，结果供试品溶液RSD为0.58%，表明供试品溶液在3 h内稳定。

2.1.5 重复性试验取前期研究所得最佳比例组成各6份，按上述供试品溶液制备方法制备样品溶液，按“2.1.1”方法测定吸收度。由标准曲线计算多糖含量，RSD为2.49%，本方法具有良好的重复性。

2.1.6 加样回收试验精密称取已知葡萄糖含量的供试样品6份，各约5 g，按上述“制备供试品溶液”法制备样品溶液共6份。再分别按100%比例准确加入上述葡萄糖标准溶液10 mL。混匀后按“2.1.1”法测定吸光度，由标准曲线计算回收率。多糖的加样平均回收率为100.09%，平均RSD为0.96%。结果见表1。

表1 多糖加样回收率试验结果

2.2 提取工艺的优选根据单因素预试验的结果，选取加水量(A)、提取时间(B)、提取次数(C)、提取温度(D)作为考察因素，以多糖含量作为考察指标，采用L9(34)正交表进行试验，筛选最佳工艺条件，正交因素水平见表2，提取工艺正交试验结果见表3、4。

表2 正交试验因素水平表

表3 正交试验结果表

表4 多糖含量方差分析结果

从表3极差可以看出，各因素对多糖提取的影响依次为：C>B>D>A，说明提取温度和提取次数对提取率影响较大。表4结果显示，因素A、D对多糖提取无显著性影响(P>0.05)，因素B、C对提取多糖的影响较显著性(P<0.05)。通过正交实验优先的最佳提取工艺为A1B3C2D3，即以8倍量水，在60 ℃时每次提取2 h，提取3次。

2.3 最佳提取工艺的验证实验准确称取最佳组方比例的药材粗粉3份各10 g，按正交实验得出的最佳提取工艺A1B3C2D3，即按60 ℃温度，加入8倍量蒸馏水，煎煮3次，每次2 h，合并滤液，滤液浓缩至约50 mL，得样品提取液，按“2.1.1”项下方法测供试品吸光度值，由标准曲线计算多糖含量，3次实验测定值基本平行，多糖含量(mg/mL)分别为17.809、17.831、17.838，平均为17.826 mg/mL，验证实验结果与正交实验结果基本吻合，说明优选的工艺条件具有可行性。

但考虑到正交实验中的提取时间对多糖提取量无显著性影响，且提取1h和提取2h相比多糖提取量无明显提高，因此优选的工艺条件改为A1B3C2D1。并按此工艺进行了3份药材用量为10g的验证试验，多糖含量(mg/mL)分别为17.816、17.793、17.845，平均为17.818。此工艺与正交试验优选出的最佳工艺相比，提取多糖量并无明显降低，且提取时间缩短。故生产上可采用8 倍量水，60 ℃提取3 次，每次1 h的工艺。

3 讨论

多糖的提取方法较多，但多数采取水煎法，因煎煮法的过程和设备要求相对简单，且多糖易溶于热水中[5]，故本次试验采用煎煮法进行提取。

根据多糖的理化性质可以选择水、醇等极性强的溶剂，考虑到工艺的成本、安全性和医院设备等方面，故选择用水作为提取溶剂、醇沉分离多糖的方法，韩燕全等[6]以95%乙醇沉淀效果最佳，沉淀较为完全，而本试验采用在样品溶液中加无水乙醇的沉淀方法，使多糖沉淀更为充分。

试验采用苯酚-硫酸法测定样品中多糖的含量，是多糖含量测定最常用的方法，其原理是多糖在硫酸作用下水解成单糖分子，脱水生成糖醛类化合物，再将其与苯酚缩合成有色物质，反应后为橙黄色溶液，可在400～490 nm处有特征吸收，多采用紫外分光光度法测定多糖含量[7-8]。因此本次实验在400～500 nm波长范围对无水葡萄糖标准品溶液和供试品溶液进行扫描，结果显示葡萄糖标准品溶液的最大吸收波长为490.2 nm，供试品溶液最大吸收波长为489.8 nm，两者最大吸收波长接近，故选择两者平均值490.2 nm作为最佳测定波长。

实验结果表明：在60 ℃时，加水量为8倍，提取时间为1 h/次，提取3次，多糖提取最充分。因此，此工艺可作为金番止泻胶囊中多糖的最佳提取工艺。

[1]国家中医药管理局《中华本草》编委会.中华本草[M].上海：上海科学技术出版社,1999.

[2]吴笳笛.多糖的作用及其研究进展[J].沈阳师范大学报(自然科学版),2008,26(2):221-223.

[3]国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[M].北京:中国医药科技出版社,2015.

[4]赖岳晓,刘佩沂,田素英,等.金番止泻胶囊不同比例提取物药效对比研究[J].中医学报，2016,31(8):1139-1141.

[5]李鹏程,张本才,陈战国.正交试验法优化太白泡沙参总多糖的提取工艺[J]．中国中药杂志，2008,33(11):1266-1268.

[6]韩燕全,黄正明,杨新波,等.苯酚-硫酸法测定不同工艺六味地黄口服液多糖的含量[J].解放军药学学报，2008,24(4):349-351.

[7]阴婉婷,李彤,马辰.改良苯酚-硫酸法测定蛹虫草多糖含量[J]．安徽农业科学，2015,433(4):117-118,173.

[8]钟世红,卫莹芳,古锐,等.苯酚-硫酸比色法测定红毛五加皮多糖的含量[J]．时珍国医国药，2010,21(2):266-267.

广东省中医药局建设中医药强省课题项目 ( 20151126) ; 2014 年广东省大学生创新创业训练计划项目( 2014036) ;广东药科大学“创新强校工程”医药化工省级实验教学示范中心资助项目。

陈建龙(1995-)，男，汉族，本科，研究方向为中药应用。E-mail:zsxqtsy@126.com

田素英(1968-)，女，汉族，副教授，硕士研究生，研究方向为中药应用研究与教学。E-mail:578820484@qq.com