贵州省食品药品检验所，贵州 贵阳 550004

伤痛克酊微生物限度检查方法建立

王俊

贵州省食品药品检验所，贵州 贵阳 550004

目的建立伤痛克酊中国药典2015版微生物限度检查方法。方法采用《中国药典》2015 年版四部“1105和1106”项下方法对伤痛克酊进行微生物限度检查方法适用性试验。结果取1∶10 供试液，采用薄膜过滤法测定需氧菌总数、平皿法(1 mL/皿)测定霉菌和酵母菌总数时，试验组回收率比值均在《中国药典》2015年版规定的0.5～2范围之内； 铜绿假单胞菌检查用胰酪大豆胨液体培养基为100 mL时，金黄色葡萄球菌检查采用薄膜过滤法，培养基用量为100 mL时，实验组均能检出试验菌。结论伤痛克酊需氧菌总数测定采用薄膜过滤法、霉菌和酵母菌总数测定采用平皿法(1 mL/皿)，铜绿假单胞菌检查用胰酪大豆胨液体培养基为100 mL，金黄色葡萄球菌检查采用薄膜过滤法，培养基用量为100 mL的方法适用于此药品的微生物限度检查，能真实反应其微生物污染情况，有效保证药品质量，降低微生物安全风险。

伤痛克酊；《中国药典》2015版；微生物限度检查

伤痛克酊其处方由姜黄、马蹄金和地柏枝组成，是一种外用酊剂。为了使微生物限度检查结果能真实反映药品受微生物污染状况，建立适合该品种的微生物限度检查方法，按照《中国药典》[1]2015年版四部通则1105非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法和1106非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法的要求进行方法适用性试验,建立了伤痛克酊的微生物限度检查方法，现将试验结果总结如下。

1 仪器与材料

1.1 供试品 伤痛克酊(规格:20mL/瓶，批号：151101、151102、151103，贵州万胜药业有限责任公司)。

1.2 仪器 1300A2生物安全柜(Thermo)、GR85DA高压蒸汽灭菌器(致微厦门仪器有限公司)、DK-98-Ⅱ电热恒温水浴锅(天津市泰斯特仪器有限公司)、BF240电热恒温培养箱(德国宾德)、MJ-250-1霉菌培养箱(上海一恒科学仪器有限公司)。

1.3 培养基 pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、胰酪大豆胨琼脂、沙氏葡萄糖液体培养基、溴化十六烷基三甲铵培养基、甘露醇氯化钠琼脂培养基均由北京陆桥技术股份有限公司生产；胰酪大豆胨液体培养基和沙氏葡萄糖琼脂来自广东环凯微生物科技有限公司。上述所有培养基均按厂家提供的使用说明书进行配制，适用性检查结果全部符合中国药典2015年版要求[1]。

1.4 菌种 试验使用的菌种均在中国药品生物制品检定所购买,金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)[CMCC( B) 26003]第3代，铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)[CMCC( B) 10104]第3代，枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)[CMCC( B) 63501]第3代，白色念珠菌(Candidaalbicans)[CMCC( F) 98001]第3代，黑曲霉(Aspergillusniger)[CMCC(F) 98003]第3代，所用菌株传代次数均符合《中国药典》2015年版四部规定的要求[1]。

2 方法

2.1 菌液制备 根据《中国药典》2015年版四部要求，将金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和枯草芽孢杆菌的培养物转种到胰酪大豆胨琼脂平板上，32.5 ℃恒温培养24 h；将白色念珠菌的培养物转种到沙氏葡萄糖琼脂平板上，22.5 ℃恒温培养48 h，挑取上面的培养物用PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液配制成所需要浓度的菌悬液。将黑曲霉的培养物接种到沙氏葡萄糖琼脂斜面上，22.5 ℃培养7 d，加人聚山梨醋80含量为0.05% (mL/mL)的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，将黑曲霉孢子洗脱形成孢子悬液。使用无菌一次性塑料滴管吸出孢子悬液至无菌试管内，再使用聚山梨醋80含量为0.05% (mL/mL)的pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液配制成试验所需浓度的孢子悬液[1-2]。

2.2 微生物计数法适用性试验

2.2.1 供试液制备 按药典规定取两个以上最小包装的伤痛克酊10 mL，加入恒温到45 ℃的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100 mL，振摇均匀即得1∶10供试液；取上述1∶10供试液10 mL加入恒温到45 ℃的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至20 mL，振摇均匀即得1∶20供试液；取1∶20供试液10 mL加入恒温到45 ℃的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至20 mL，振摇均匀即得1∶40供试液；取1∶10供试液10 mL加入恒温到45 ℃的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至60 mL，振摇均匀即得1∶60供试液；取1∶10供试液10 mL加入恒温到45 ℃的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100 mL，振摇均匀即得1∶100供试液。

2.2.2 微生物计数法适用性预实验 选用批号151101的伤痛克酊作为预实验供试品。

2.2.2.1 试验组 取2.2.1制备好的1∶10、1∶20、1∶40、1∶60、1∶100供试液，加入不大于供试液体积1%的试验菌液(铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉)，充分振摇均匀，最终使每1 mL供试液中所含菌量不大于100 cfu。分别取1 mL注入无菌平皿中，立即倾注温度保持在46 ℃左右的胰酪大豆胨琼脂(铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌和黑曲霉)和沙氏葡萄糖琼脂(白色念珠菌和黑曲霉)，每一株试验菌同时制备2个平皿，待琼脂凝固后翻转平皿，胰酪大豆胨琼脂放置32.5 ℃恒温培养箱中培养3 d，沙氏葡萄糖琼脂放置22.5 ℃霉菌培养箱中培养5 d，测定其平皿上生长的菌数。

2.2.2.2 供试品对照组 取2.2.1制备好的供试液，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液替换菌液，操作方法和试验组相同。

2.2.2.3 菌液对照组 取pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液替换供试液，操作方法和试验组相同。

2.2.3 微生物计数法适用性正式实验

2.2.3.1 试验组 取伤痛克酊151101、151102、151103 3个批号1∶10供试液，加入不大于供试液体积1%的试验菌液(铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌和黑曲霉)，充分振摇混匀，各吸取1 mL进行薄膜过滤，按无菌操作要求取滤膜，滤膜面朝上平贴在胰酪大豆胨琼脂培养皿上，每一株试验菌同时制备2个平皿，放置32.5 ℃恒温培养箱中培养3 d，测定其平皿上生长的菌数；分别取含白色念珠菌、黑曲霉的供试液1 mL注入平皿中，每株试验菌同时制备2个平皿，立即倾注冷却至46 ℃左右的沙氏葡萄糖琼脂，放置22.5 ℃霉菌培养箱中培养5 d，测定其平皿上生长的菌数。

2.2.3.2 供试品对照组 取151101、151102、151103 3个批号的伤痛克酊供试液，以pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液替换菌液，操作方法和试验组相同。

2.2.3.3 菌液对照组 取pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液替换供试液，操作方法和试验组相同。

2.3 控制菌检查方法适用性试验

2.3.1 控制菌检查方法预实验

2.3.1.1 供试液的制备 制备方法同“2.2.1”。

2.3.1.2 金黄色葡萄球菌检查预试验 选用批号为151101的伤痛克酊1∶10供试液10 mL，分别接种至100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000 mL胰酪大豆胨液体培养基中，加入“2.1”中制备的金黄色葡萄球菌菌悬液(总量小于100cfu)，放置32.5℃恒温培养18 h；挑取上面的培养物划线接种至甘露醇氯化钠琼脂培养基平板上，放置32.5 ℃恒温培养24 h。取3份1∶10供试液10 mL薄膜过滤(滤膜用耐乙醇材质)，一份用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗1次，每次100 mL/膜，1份用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗2次，每次100 mL/膜，另外1份用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗3次，每次100 mL/膜，取出滤膜，放置于胰酪大豆胨液体培养基100 mL中，加入“2.1”中制备的金黄色葡萄球菌菌悬液(总量小于100cfu)，放置32.5 ℃恒温培养18 h；挑取上面的培养物划线接种于甘露醇氯化钠琼脂培养基平板上，放置32.5 ℃恒温培养24 h。

2.3.1.3 铜绿假单胞菌检查预试验 选用批号为151101的伤痛克酊1∶10供试液10 mL，分别接种至100 mL、200 mL胰酪大豆胨液体培养基，再加入“2.1”中制备的铜绿假单胞菌菌悬液(总量小于100 cfu)，放置32.5 ℃培养18 h；挑取上面的培养物划线接种于溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基平板上，放置32.5 ℃培养24 h。

2.3.2 控制菌检查方法正式实验

2.3.2.1 供试液的制备 制备方法同“2.2.1”。

2.3.2.2 金黄色葡萄球菌检查正式试验 分别取批号为151101、151102、151103的伤痛克酊1∶10供试液10 mL，薄膜过滤(滤膜用耐乙醇材质)，用pH7.0无菌氯化钠—蛋白胨缓冲液冲洗2次，每次100 mL/膜，取出滤膜置于胰酪大豆胨液体培养基100 mL中，加入“2.1”中制备的金黄色葡萄球菌菌悬液(总量小于100 cfu)，放置32.5 ℃培养18 h；挑取上面的培养物划线接种到甘露醇氯化钠琼脂培养基平板上，放置32.5 ℃培养24 h。

2.3.2.3 铜绿假单胞菌检查正式试验 分别取批号为151101、151102、151103的伤痛克酊1∶10供试液10 mL，分别接种至100 mL胰酪大豆胨液体培养基中，再加入“2.1”中制备的铜绿假单胞菌菌悬液(总量小于100cfu)，放置32.5 ℃培养18 h；挑取上面的培养物划线接种于溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基平板上，放置32.5 ℃培养24 h。

3 结果

3.1 计数方法适用性试验 按照这个方法计算回收率比值：试验组菌回收率比值=(试验组菌落数-供试品对照组菌落数)/菌液对照组菌落数。

试验结果见表1-1、表1-2、表1-3、表1-4、表2-1、表2-2，由试验结果看，伤痛克酊对金黄色葡萄球菌具有抑菌作用，采用薄膜过滤法可消除其抑菌作用，故采用薄膜过滤法进行需氧菌总数检查，霉菌采用平皿法(1mL/皿)进行霉菌和酵母菌总数计数时3个批号试验组回收率比值均在《中国药典》2015年版规定的0.5～2要求之内，表明该方法的重现性较好，适用于伤痛克酊的微生物限度检查中微生物计数法检查，能有效保证该项目检测结果的准确性。

表1-1 需氧菌总数计数方法适用性回收试验预试验记录

表1-2 需氧菌总数计数方法适用性回收试验预试验记录

表1-3 需氧菌总数计数方法适用性回收试验预试验记录

表1-4 需氧菌总数计数方法适用性回收试验正式试验记录

表2-1 霉菌和酵母菌总数计数方法适用性回收试验预实验记录

表2-2 霉菌和酵母菌计数方法适用性回收试验正式试验记录

3.2 控制菌检查方法适用性试验 通过预试验，铜绿假单胞菌检查培养基使用量为100 mL和200 mL时，试验组均能完全检出铜绿假单胞菌。金黄色葡萄球菌检查培养基使用量为100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000 mL时，试验组均不能检出金黄色葡萄球菌；采用薄膜过滤，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗，冲洗量为100 mL和200 mL时，试验组均能检出金黄色葡萄球菌。据此推论铜绿假单胞菌检查培养基使用量为100 mL，金黄色葡萄球菌检查采用薄膜过滤法，冲洗量为100 mL，培养基使用量为100 mL的方法可用于伤痛克酊控制菌检查，按照这个方法对伤痛克酊3个批号供试品进行正式试验，3个批号的试验组均能正常检出试验菌。说明伤痛克酊用这个方法进行控制菌检查时，方法可行，重现性好，可用于其微生物限度检查中控制菌检查，能真实反应其微生物污染情况，有效保证药品质量，降低微生物安全风险。

4 讨论

微生物检查作为药品安全性的重要指标，其标准的制定也随着科技的发展、生产工艺水平的提高、国际贸易的日益增多及与国际标准接轨的需求而逐步修订提高[3]。具有抑菌性药物的微生物限度检查结果的准确性，主要取决于样品本身在试验条件下是否抑制被检微生物的生长繁殖，检验时应排除其抑制作用，使之不干扰染菌限度检验，结果方属有效[4-5]。为了保证药品质量，应该按照《中国药典》2015版的相关要求建立适合伤痛克酊的微生物限度检查方法，在方法学适用性试验过程中，通过预实验知道伤痛克酊对需氧菌有抑制作用、对霉菌和酵母菌没有抑制作用，故采用薄膜过滤法进行需氧菌计数检查，使用1∶10供试液1 mL/皿进行霉菌和酵母菌计数检查；而对金黄色葡萄球菌有抑制作用，故采用薄膜过滤法，冲洗量为100 mL，培养基使用量为100 mL的方法进行检查；对铜绿假单胞菌没有抑制作用，采用培养基使用量为100 mL的方法进行检查。

微生物限度检查可以正确地反映药品企业生产工艺及处方比例的合理性及科学性，是保证和进行药品卫生质量的重要手段和方法[6]。通过方法学适用性试验得出的上述微生物限度检查方法是有效的、可行的，可用于伤痛克酊的微生物限度检查，检测结果能正确反映产品被微生物污染的真实状况，切实做到有效控制和提高药品质量，从而降低药品由微生物污染带来的安全风险。

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典(四部)[M]. 北京：中国医药科技出版社，2015:140-149.

[2]中国药品生物制品检定所，中国药品检验总所．中国药品检验标准操作规范[M].北京：中国医药科技出版社，2010：356-357．

[3]杨晓莉，李辉，马英英，等.中国药典2015年版非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法解读[J]．药物分析杂志，2016,36(6)：1102．

[4]杜尔再，闹闹尔再．牛黄解毒片微生物限度检查方法的探讨[J]．中国民族民间医药，2012,21(12)：46-47．

[5] 靳维.伏立康唑胶囊微生物限度检查法及有效性验证试验研究[J].天津药学，2010,22(4)：1-3．

[6] 马绪荣，苏德模．药品微生物学检验手册[M]．北京：科学出版社，2000：59．

EstablishmentofMicrobialLimitInspectionMethodofPainTincture

WANG Jun

Guizhou Province Food and Drug Inspection，Guiyang 550004,China

ObjectiveTo establish a method for microbial limit examination of Chinese Pharmacopoeia (2015 edition)about Pain tincture .MethodsMicrobial limit inspection method suitability test about Pain tincture was carried out according to “1105 and 1106”in four version of Chinese Pharmacopoeia( 2015 Edition).ResultsFrom 1 to 10 for the test solution，using the membrane filter method on the determination of the total number of aerobe，AGAR method (1 mL/dish) determination of the total number of mold and yeast，the recovery rate in the experimental group were range of 0.5 ～ 2 in the provisions of China Pharmacopoeia (2015 edition)；control bacteria were examined when Pseudomonas aeruginosa check with pancreatic dairy soy peptone liquid medium for 100 mL, Staphylococcus aureus, check the membrane filtration method is adopted and medium dosage were 100 mL.ConclusionDetermination of the total number of aerobe in Pain tincture using the membrane filter method，Determination of the total number of mold and yeast using the method of AGAR (1 mL/dish)；Pseudomonas aeruginosa check with pancreatic dairy soy peptone liquid medium for 100 mL，Staphylococcus aureus, check the membrane filtration method is adopted,Medium dosage for 100 mL method，the method Suitable for microbial limit examination of the drug, can reflect the microbial contamination condition, effectively guarantee the quality of drugs, reduce microbial safety risk.

Pain tincture ；Chinese Pharmacopoeia (2015 Edition)；Microbiological examination

王俊(1974-)，男，本科，副主任技师，研究方向为食品、药品、化妆品等微生物检测。E-mail:362983170@qq.com

R284.1

A

1007-8517(2017)23-0034-05

2017-10-22 编辑：邓佳丽)