翁翠莲，刘庆华（1.福建省立医院呼吸内科，福建 福州 50001；2.厦门大学附属第一医院呼吸内科，福建 厦门 51004；.福建省立医院耳鼻咽喉重点专科，福建 福州 50001）

肺内（肺炎等）和肺外病因（脓毒症等）都可导致急性肺损伤（acute lung injury，ALI），其死亡率波动在11% ～ 68%，其中细菌感染是ALI主要原因之一。在ALI发病过程中，肺血管内皮细胞起着关键作用。当ALI时，肺血管内皮的功能和完整性发生改变，导致内皮细胞产生更多促炎和趋化因子、血管通透性增加，促进肺水肿形成[1-2]。但迄今为止证实唯一有效治疗ALI的方法就是采用小潮气量（6 mL.kg-1）的机械通气治疗，在药物方面仍未找到特异、有效的药物，有研究表明糖皮质激素对晚期急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）（患病7 ～ 24 d）可明显改善低氧血症和顺应性，缩短其休克和机械通气时间。因此探讨药物治疗ALI具有重要意义。本实验采用内毒素（ET）制作ALI模型，地塞米松作为干预药物，通过分析血氧饱和度及血管紧张素转化酶（angiotensin converting enzyme，ACE）活性的动态变化，旨为临床防治ALI提供药物治疗实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

内毒素（ET，O55 : B5，Sigma公司）；地塞米松（Sigma公司，批号：D4092）；ACE试剂盒（海军总医院提供，批号：100201）。

1.2 动物分组

24只3个月龄、雄性日本大耳白兔（购自于北京科学动物养殖中心，许可证号：SCXK北京2002-2005）。将24只动物，随机分为3组，每组8只，分别为生理盐水组（A组）、ET损伤组（B组）、地塞米松干预+ ET损伤组（C组）。

1.3 实验方法

1.3.1 ALI兔模型的制作 在日本大耳白兔的耳缘静脉注射20%乌拉坦（5 mL.kg-1）用以麻醉动物，分别分离兔的左侧颈动静脉，分别用于测定血氧饱和度（PaO2/FiO2），静脉用于给药、采血。A组经颈静脉5 min内注射生理盐水（NS）2 mL.kg-1。B组先将ET 700µg.kg-1用2 mL NS溶解，通过颈静脉5 min内注射完毕，随后再次注射NS 1次，两次NS的量为2 mL.kg-1。C组先将地塞米松5 mg.kg-1用2 mL NS溶解后注射，10 min后再注射与B组等量的ET，两次所给的液体总量2 mL.kg-1。各组分别在试验0、0.5、1、2、4 h采集动脉血进行血气分析检测，根据PaO2/FiO2计算氧合指数。1.3.2 肺组织湿重/干重比值、肺水含量测定 在试验4 h末使用放血疗法处死日本大耳白兔，取右上肺组织称重肺组织湿重，后将其放置在90℃的恒温烤箱中24 h，后称重为干重，计算出肺组织湿重/干重比值，肺水含量=（湿重–干重）/湿重×100%。

1.3.3 肺组织病理学检查 4 h后处死日本大耳白兔，取新鲜右下肺叶组织用10%甲醛固定，石蜡包埋，HE染色，使用奥林巴斯显微镜行光镜下观察。1.3.4 血清ACE测定 ACE检测试剂盒由海军总医院提供，ACE活性的检测步骤参照试剂盒说明书进行。采用多功能紫外分光光度计比色法（波长228 nm）测定ACE活性，测定数据OD值代入试剂盒说明书所列公式计算ACE活性。

1.4 统计学处理

使用均数±标准差表示数据，PaO2/FiO2、血液ACE活性采用SPSS 20.0软件进行重复测量方差分析，使用单因素方差分析对其余数据进行分析，组间比较使用Bonferroni方法，以P＜ 0.05为差异具有显著性。

2 结果

2.1 各时间点PaO2/FiO2结果

试验前，3组动物PaO2/FiO2比较无显著性差异。A组PaO2/FiO2在整个4 h的实验过程中保持相对稳定，B组动物在0.5 h时PaO2/FiO2出现下降趋势，降至最低均数为（265.4±70.2）mm Hg（＜ 300 mm Hg），随后PaO2/FiO2呈现逐渐上升趋势；C组PaO2/FiO2在0.5 h、1 h稍有下降，与A组比较无显著性差异。详见表1。

表1 3组PaO2/FiO2变化结果. n = 8，± s ，mm HgTab 1 Changes of PaO2/FiO2 in three groups. n = 8,± s , mm Hg

表1 3组PaO2/FiO2变化结果. n = 8，± s ，mm HgTab 1 Changes of PaO2/FiO2 in three groups. n = 8,± s , mm Hg

注：与A组比较，▲P ＜ 0.05，▲▲P ＜ 0.01；与B组比较，*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01Note: compared with group A, ▲P ＜ 0.05, ▲▲P ＜ 0.01; compared with group B, *P ＜ 0.05, **P ＜ 0.01

组别 0 h 0.5 h 1 h 2 h 4 h A组 433.2±36.8425.9±29.4 467.0±38.0 454.5±32.5 439.8±23.8 B组 440.2±35.4265.4±70.2▲▲ 316.4±92.4▲▲ 394.5±115.0457.9±84.7 C组 445.8±31.6408.2±29.7** 440.1±45.7** 510.5±45.6**491.5±43.7

2.2 兔肺组织湿重/干重比值、肺水含量结果

与A组比较，B组肺组织湿重/干重比值、肺水含量明显升高。与B组比较，C组肺组织湿重/干重比值、肺水含量显著降低，与A组比较无显著性差异。见表2。

表2 3组肺组织湿重/干重比值、肺水含量结果. n = 8，± sTab 2 The lung wet/dry (W/D) ratio, lung water content in three groups. n = 8,± s

表2 3组肺组织湿重/干重比值、肺水含量结果. n = 8，± sTab 2 The lung wet/dry (W/D) ratio, lung water content in three groups. n = 8,± s

注：与A组比较，▲P ＜ 0.05，▲▲P ＜ 0.01；与B组比较， *P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01Note: compared with group A, ▲P ＜ 0.05, ▲▲P ＜ 0.01; compared with group B, *P ＜ 0.05, **P ＜ 0.01

组别 肺组织湿重/干重比值 肺水含量/%A组 4.706±0.101 0.787±0.005 B组 5.354±0.253▲▲ 0.813±0.009▲▲C组 4.723±0.275** 0.788±0.012**

2.3 肺组织病理学检查结果

A组兔肺组织结构大致正常，肺泡腔内无明显渗出、出血，肺组织血管壁、血管内皮细胞结构大致正常。B组兔肺组织血管内皮细胞明显肿胀，血栓形成，血管壁可见较多的中性粒细胞贴壁，肺泡腔出现渗出，水肿液形成，透明膜形成。C组兔肺组织肺泡腔渗出、血管内皮细胞水肿、出血、中性粒细胞贴壁现象低于B组。

2.4 血清ACE测定结果

静注内毒素前，3组动物ACE无显著差异。A组ACE在整个实验过程中保持相对稳定，与A组比较，B组ACE活性在给予ET 0.5 h开始明显升高（与A组比较，68.39 ± 6.29 u.mL-1vs 47.97 ± 8.87 u.mL-1，P=0.001），血清ACE活性值在1 h达到峰值（80.13 ± 12.97 u.mL-1vs 53.59 ± 10.41 u.mL-1，与A组比较，P= 0.001），2 h后开始下降，在实验4 h时ACE活性仍保持在较高水平（64.66±7.45 u.mL-1vs 47.86±13.69 u.mL-1，与A组比较，P= 0.016)。与A组比较，C组血清ACE活性也出现升高，差异无显著性（P＞ 0.05）。与B组比较，C组在0.5、1、2、4 h ACE活性显著低于B组（P= 0.014，P= 0.006，P= 0.002，P= 0.017），见表3。

表3 3组血清ACE活性变化结果. u.mL-1，n = 8Tab 3 Changes of serum ACE activity in three groups. u.mL-1, n = 8

3 讨论

本研究采用内毒素方法导致兔ALI。B组动物给予ET后，出现PaO2/FiO2降低（265.4 ＜ 300 mm Hg，PaO2/FiO2符合ALI标准），病理结果可见兔肺组织血管内皮细胞明显肿胀，血栓形成，血管壁可见较多的中性粒细胞贴壁，肺泡腔出现渗出，水肿液、透明膜形成。与A组比较，B组肺组织湿重/干重比值和肺水含量明显高于A组，上述结果证实采用ET制作的动物模型符合ALI改变。

ACE合成、释放的主要部位在肺毛细血管床。ACE主要负责将血管紧张素Ⅰ转换为血管紧张素Ⅱ，生成的血管紧张素Ⅱ通过与血管紧张素Ⅱ的1型受体结合后促进血管收缩，上调许多促炎基因（如NF-κB，IL-6，TNF-α）的表达、促进炎症细胞增殖和抑制凋亡[3-4]。血清ACE活性的动态改变提示肺血管内皮细胞损伤的程度、内皮损伤的动态变化过程。有研究表明在肺部疾病中RAS发挥着重要作用，ACE在ALI患者的肺泡灌洗液中升高，且ALI死亡率与ACE基因水平呈正相关[5]。ACE同系物（ACE2）可通过抑制减少血管紧张素Ⅱ的含量，以拮抗ACE的作用[6-7]。有相关研究结果表明ACE抑制剂卡托普利可作为ALI的一个治疗药物，这表明肾素-血管紧张素系统在ALI的病理生理中起着核心作用，抑制ACE/血管紧张素Ⅱ/血管紧张素Ⅱ1R轴可以改善ALI的症状[7]。本实验结果显示A组动物血清ACE在整个实验过程中保持相对稳定。B组动物在0.5 h血清ACE活性开始升高，1 h时达到峰值，2 h后逐渐下降，但在ET注射4 h时仍保持在较高水平。具体的机制可能为：在ET所致肺损伤的早期，ET使内皮细胞细胞膜发生改变，促使分布于血管腔面的血管内皮细胞质膜和内皮细胞小凹处的ACE被大量释放入血，血清ACE活性升高；随着ALI的逐渐进展，肺血管内皮细胞的细胞内的细胞器受损， 致使ACE的合成减少，同时ACE下游产物—血管紧张素Ⅱ使肺血管的张力增加，微血管静水压升高，并能促进内皮细胞收缩、增大细胞间距，使肺内血管通透性增加，使血管循环ACE进入肺泡腔可能导致血清ACE含量及活性均降低。在本实验中内毒素组肺组织湿重/干重比值和肺水含量明显高于对照组，病理结果提示肺组织血管内皮细胞明显肿胀，血栓形成，血管壁可见较多的中性粒细胞贴壁，肺泡腔出现渗出，水肿液形成，透明膜形成，上述结果表明内毒素对血管内皮细胞有直接损伤作用。地塞米松组动物血清ACE活性在0.5 h开始升高，1 h达到峰值，2 h后逐渐下降，与A组相比无显著性差异（P＞ 0.05）。C组肺组织湿重/干重比值、肺水含量与B组比较明显降低，病理结果示肺泡腔渗出、血管内皮细胞水肿、出血、中性粒细胞贴壁现象明显轻于B组。这表明地塞米松对内毒素性ALI具有一定的保护作用，其保护机理可能与其对内皮细胞的直接保护作用有关，其相关机制可能是地塞米松具有稳定内皮细胞膜，降低肺微血管通透性，抑制炎症细胞聚集等有关。

综上，本实验研究结果表明，使用ET（700µg.kg-1）可以制作兔急性肺损伤动物模型，地塞米松可以抑制ALI血清ACE的活性，降低肺组织湿重/干重比值、肺水含量，减轻肺组织病理损害。这在一定程度上提示地塞米松可以通过肺微血管内皮细胞对ET所致的ALI产生一定的保护作用。

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