何 梅，罗 勋

生物与制药

UVB对秀丽隐杆线虫的毒性效应及机制研究

何 梅，罗 勋

紫外线（UV）辐射可导致生物有机体多种损伤，其中UVB起重要作用，UVB照射所造成的损伤主要是皮肤老化（光老化）和癌症.但其诱导的细胞凋亡和生殖毒性及机制至今仍不清楚.本研究利用UVB对模式生物秀丽隐杆线虫进行辐照，评估UVB对秀丽隐杆线虫生殖腺细胞凋亡和生殖毒性的影响，及参与UVB作用的信号途径；并分析DNA损伤反应DDR（DNA Damage Reaction，DDR）途径中的关键拦截点基因.结果表明：UVB能诱导秀丽隐杆线虫生殖腺凋亡细胞显著增加及线虫生殖腺有丝分裂区细胞数与线虫子代数量明显减少；在DDR信号转导途径中，其中关键拦截点基因CED-3、CED-4、CED-9、EGL-1、HUS-1和CEP-1均参与了对UVB诱导的细胞凋亡调控.本研究结果揭示了UVB可诱导DNA损伤，从而导致显著的生殖毒性效应.

UVB；细胞凋亡；DDR途径；生殖毒性；秀丽隐杆线虫

紫外线（UV）是波长100～400nm的电磁波.UV的形式包括UVA（315～400nm），UVB（280～315nm）和UVC（100～280nm）.经UV轻度暴露有助于增加皮肤黑色素的产生［1］，可增强先天免疫.UV照射也有助于维生素D合成.UVB的波段在蛋白质和核酸的最大吸收峰附近，其能量被这些大分子吸收后所发生的光化学反应，会对生物体产生较为明显的影响.适量UVB照射是生物体维持正常的生命活动所不可缺少的，如可以促进骨骼中钙的吸收，但过量的UVB照射会对生物体产生损害，持续接触UVB可能导致慢性不可逆转的损伤范围（从太阳烧伤到皮肤癌）.McK-enzie等人［2］研究发现，中纬度地区夏季紫外线暴露1分钟将合成足够的维生素D.然而，持续暴露至15min即可导致皮肤损伤.皮肤长期暴露于紫外线辐射会导致过早衰老或光老化，其特点是皱纹形成，色素沉着病变或老年斑，并减少皮肤的完整性［3］.UVB照射可以通过碎片来表征并减少皮肤中的胶原蛋白的产生.降低皮肤中的紫外线辐射剂量会影响其活性胶原蛋白［4］.随着照射强度增加，存在于细胞外基质中的胶原蛋白将被破坏，且新胶原蛋白合成将受到阻碍.另研究发现，经UVB暴露可导致胶原蛋白降解、基质金属蛋白酶的上调（MMP）和活性氧（ROS）积累将导致光老化.Bonaventura等［5］的研究发现，UVB照射能够阻碍海胆骨的正常发育.UVB照射对植物也能产生严重的损害作用，如可以破坏植物的DNA，影响光合作用，减弱其自身的防护作用，抑制生长等［6］.然而，经UVB暴露后是否会导致生殖毒性，至今尚未见报道.

秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans，C.elegans）作为模式生物，被广泛用于生殖毒性方面的研究.Wang等［7］研究环境胁迫作用后可显著诱导秀丽隐杆线虫生殖腺细胞凋亡增加.很多具有与凋亡及衰老相关的信号通路，以及信号通路中的主要基因原件也已被阐释清楚［8］.

本研究利用UVB对秀丽隐杆线虫进行暴露，通过评价经过UVB暴露后的线虫生殖毒性效应，分析DNA损伤相关的信号通路，探索UVB照射导致的毒性效应机制.

1 材料与方法

1.1 UVB的准备和辐照方法

所有实验的处理都是利用UVB照射，波长294nm，照射强度为7.5μW/cm2.幼虫接种在小皿上，用UVB照射时间分别为0、5、10、15、20s，成虫后测定各类指标.

1.2 C.elegans品系及培养

线虫品系有野生型 N2、hus-1（WS2277）、cep-1（VC172）、egl-1（MT1082）、ced-9（MT4770）、ced-4（MT2547）、ced-3（MT1522）.实验室保种的野生型N2及其他所有品系的C.elegans均购自国际线虫遗传中心（Caenorhabditis Genetics Center，CGC，University of Minnesota，USA），用标准的线虫生长培养基（Nematode growth medium，NGM）于20°C培养，以活的Escherichia coliOP50细菌作为食物源.所有C.elegans实验操作程序均按照标准化操作完成.

1.3 UVB毒性效应评价

（1）生殖腺细胞凋亡实验.用吖啶橙（Acridine orange，AO）（Sigma）对秀丽隐杆线虫进行染色检测生殖腺细胞凋亡［9］.被UVB暴露处理后的50～60条L4期幼虫；20°C黑暗中培养24h后，线虫被移入浓度为25μg/mL的500μL AO溶液中，20°C黑暗中染色1h；然后，将染色后的线虫移入新的NGM培养皿上恢复培养40min，用铂丝针将恢复后的线虫挑出置载玻片上叠氮化钠溶液中，盖上盖玻片，于Olympus IX71荧光显微镜（Olympus，Tokyo，Japan）下，观察计数AO染色呈阳性的凋亡细胞尸体.

（2）检测生殖腺有丝分裂区细胞数.处理方法同细胞凋亡的方法，照射后经72h发育到成虫，再经12h分别测定其生殖腺游离端有丝分裂的细胞的个数.解剖线虫，让其暴露生殖腺，染色后在×63显微镜下拍照（用蔡司显微镜拍摄），取游离端50mm进行计数.

Craig等对C.elegans生殖腺有丝分裂期细胞数目评测程序已有报道，我们对其进行了适当的调整，并已有相应的文章刊出［10-11］.首先，使用1μg/mL 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）在避光条件下将虫体切开暴露出的生殖腺染色10min，然后，用PBST（PBS和0.1%Tween-20）5min洗3次，接着使用粘裱液（pH 8.0，90%甘油，20mM三羟甲基氨基甲烷和1mg/mL对苯二胺混合物）将生殖腺固定在载玻片上，盖上盖玻片，用指甲油将盖玻片边缘粘合封口，于Olympus IX71荧光显微镜下计数生殖腺有丝分裂区（从远端细胞大约20个细胞的距离）细胞数目.

（3）子代数量实验.子代数量实验按照前人描述的方法实施.将UVB暴露照射处理的C.elegansL1期幼虫，培养至L4期后，每天将虫子转到新的培养皿中培养，直到线虫停止产卵；移去线虫的培养皿经过24h后，于解剖镜下计数培养皿中刚孵化不久的幼虫数目.将产卵期每天计数的单个母体所产幼虫总和加起来就是一个处理线虫的子代数目.该实验重复三次.

1.4 数据统计分析

所有数据应用SPSS 19.0软件处理，所有结果均以平均值±标准误表示.使用单因素方差分析将对照组与其他任意一组分析平均差，使用双因素方差分析分析不同处理组间的平均差.统计学上具有显著意义的评判标准是P＜0.05.作图应用origin软件.

2 结果

2.1 UVB诱导C.elegans生殖腺减数分裂期细胞凋亡数量显著增加

秀丽隐杆线虫daf-2编码一个胰岛素样生长因子-1受体（IGF-1R），调节多种功能.为了检测daf-2是否参与银纳米颗粒诱导线虫生殖细胞凋亡，携带突变daf-2（e1370）丧失功能等位基因的线虫被喂食不同剂量银纳米暴露处理的大肠杆菌.喂食24h后，线虫生殖腺细胞尸体被AO活体染色，凋亡细胞显示亮绿色，而减数分裂区完整的细胞呈均匀的绿色（图1A和B）.与N2相比，携带daf-2等位基因的线虫产生更多的生殖细胞尸体（图1C）.与哺乳动物PI3K、AGE-1同源的秀丽隐杆线虫的基因位于daf-2的下游.银纳米颗粒通过大肠杆菌携带暴露处理的线虫，与N2相比，在age-1（hx546）生殖腺细胞凋亡数目没有显著差别，而age-1（mg109）针对所有暴露剂量比N2产生更多的生殖细胞尸体.UVB诱导后，与N2相比，HUS-1（lf）导致生殖细胞凋亡数增加，不同辐射剂量下凋亡数目没有显著性变化（图1D）；CEP-1（lf）突变体生殖腺细胞凋亡同样增加，与HUS-1（lf）有相同趋势（图1E）.图2F显示与N2相比，EGL-1（lf）导致生殖细胞凋亡数增加，但与自身相比，凋亡数目没有显著性变化；图2G显示CED-9（lf）突变体生殖腺细胞凋亡明显减少，与EGL-1（lf）有相同趋势.图3H显示与N2相比，CED-4（lf）导致生殖细胞凋亡数明显减少，但与自身相比，凋亡数目没有显著性变化；图3I显示CED-3（lf）突变体生殖腺细胞凋亡数亦明显减少，与CED-4（lf）有相同趋势.

图1 UVB诱导野生型N2、突变体HUS-1（lf）和突变体CEP-1（lf）C.elegans生殖腺细胞凋亡

A.DNA损伤相关信号通路中的几个关键拦截基因；B.未经UVB暴露处理的对照组野生型N2生殖腺细胞凋亡照片；C.UVB暴露处理20s野生型N2生殖腺细胞凋亡照片，白色箭头指示生殖腺细胞尸体，标尺长度为50μm；D.与N2相比HUS-1（lf）导致生殖细胞凋亡数；E.与N2相比CEP-1（lf）突变体生殖腺细胞凋亡.

注：*表示P＜0.05，即代表与未经暴露处理的对照组N2相比有显著性差异.**表示P＜0.05，即代表与经UVB暴露处理的对照组N2相比有显著性差异.为了方便比较，在本文所有图中对N2野生型凋亡细胞进行比较均与图1表示相同.

图2 UVB诱导野生型N2、突变体EGL-1（lf）（F）和突变体CED-9（lf）（G）C.elegans生殖腺细胞凋亡

图3 UVB诱导野生型N2、突变体CED-4（lf）（H）和突变体CED-3（lf）（I）C.elegans生殖腺细胞凋亡

2.2 UVB诱导C.elegans生殖腺有丝分裂期细胞数显著减少

针对C.elegans发育来说，有毒物质潜在的毒性效应，生殖提供了一个很好的指示作用.为了研究UVB对C.elegans发育的胚胎致死效应可能的机制，我们检测分析了C.elegans的细胞周期拦截.实验结果如图4b所示，在实验室使用同一辐照强度的不同辐照时间对C.elegans暴露处理条件下，C.elegans的生殖腺有丝分裂区细胞数目明显减少.图4c所示，UVB暴露时间延长，有丝分裂区细胞数明显减少，UVB辐射剂量所诱导的C.elegans的生殖腺有丝分裂区细胞数目与UVB暴露时间呈明显的剂量依赖效应.

图4 UVB诱导野生型N2 C.elegans生殖腺有丝分裂区细胞增殖降低

2.3 UVB诱导C.elegans子代数量明显降低

为了进一步阐明UVB对C.elegans发育的胚胎致死效应可能的原因，我们还分析了C.elegans的子代数目.实验结果如图5所示，在实验室使用同一辐照强度的不同辐照时间对C.elegans暴露处理条件下，C.elegans产生的子代数量明显减少，UVB暴露剂量所诱导的C.elegans的子代数量与UVB暴露时间呈明显的剂量依赖效应.

图5 UVB诱导野生型N2 C.elegans子代数量

3 讨论

至今，UVB对细菌或者别的生物有机体具有毒性作用，但是，UVB对环境的潜在生态毒性及其机制尚不能给出合理解释，尤其是UVB对生物有机体产生毒性的时间效应.在本研究使用模式生物C.elegans研究UVB的毒性的时间效应及机制.根据已有的UV作为杀菌手段［12-13］，UVB暴露剂量被设置在1～25μg/ml.

本研究结果表明UVB暴露诱导秀丽隐杆线虫生殖细胞凋亡，揭示秀丽隐杆线虫可作为一个体内模型来评价UVB暴露诱导细胞凋亡的途径.已有研究结果显示UV诱导多种细胞系和组织的细胞凋亡，但是涉及该过程的潜在信号转导途径尚未于哺乳动物体内实验给予确切解释.为了探索UVB诱导细胞凋亡可能涉及的信号通路，我们使用已知哺乳动物基因的线虫的突变等位基因参与凋亡调控进行评价.研究结果显示DNA损伤应答DDR信号基因HUS-1，EGL-1，CED-9，CED-4和CED-3在UV-B诱导的生殖细胞凋亡中是必需的.

DDR信号：在秀丽隐杆线虫中，生殖细胞凋亡受到进化上保守的核心凋亡机制的调控；杀死过程需要caspase蛋白CED-3和凋亡蛋白酶激活因子1（Apaf-1）同源物CED-4.秀丽隐杆线虫CED-9编码与哺乳动物Bcl-2同源的蛋白质，其通过隔离CED-3和CED-4来抑制程序性细胞死亡.本研究显示UVB诱导的生殖凋亡细胞在ced-3（n717）和ced-4（n1162）突变体中分别大大降低到接近背景（图3H、I）.相反，经UVB暴露处理的ced-9（n1950）突变体秀丽隐杆线虫生殖腺凋亡细胞数显著增加，且无时间效应关系（图2G）.这些数据表明UVB可诱导秀丽隐杆线虫程序性生殖细胞死亡.

细胞凋亡是响应于活跃的生理刺激或环境毒素而引起的组织细胞死亡形式.在秀丽隐杆线虫中，生殖细胞凋亡可以通过辐射，重金属和某些致病菌等各种环境胁迫来启动.本研究结果亦显示UVB诱导了生殖细胞凋亡明显增加（图1C、D、E），其信号途径组成原件抗凋亡Bcl-2直系同源物CED-9，Apaf-1直系同源物CED-4的核心细胞凋亡信号传导途径半胱天冬酶CED-3（图3I），此两种基因缺陷型突变体经UVB暴露后无时间效应关系，从而表明此两种基因参与抗凋亡调控.秀丽隐杆线虫CEP-1是具有保守DNA结合结构域的p53的古老直向同源物.CEP-1通过激活靶基因egl-1的转录来诱导生殖细胞死亡.我们通过使用cep-1和egl-1基因缺陷型突变体经UVB暴露后计数其生殖腺凋亡细胞数进行评价获得的数据表明，UVB通过基因毒性途径诱导秀丽隐杆线虫的生殖细胞凋亡（图1E和图2F）.

针对C.elegans发育来说，有毒物质潜在的毒性效应，生殖提供了一个很好的指示作用.为了研究UVB对C.elegans发育的胚胎致死效应来检测其潜在的危害，我们检测分析了C.elegans的细胞周期拦截和子代数目.实验结果如图4和图5所示，经UVB暴露处理后，C.elegans的生殖腺有丝分裂区细胞数目明显减少，子代数量显著降低.此结果提示经UVB暴露的秀丽隐杆线虫诱导了生殖腺细胞凋亡上升，进而导致生殖能力下降；而有丝分裂区细胞数目减少也是造成生殖腺凋亡细胞数目增加的直接原因，因为UVB照射损伤了秀丽隐杆线虫有丝分裂区细胞.本研究显示UVB导致秀丽隐杆线虫繁殖力下降的结果相同［14］.

综上所述，以秀丽隐杆线虫作为体内模型，本研究证明了DDR信号传导成分HUS-1，CEP-1，EGL-1，CED-9，CED-3和CED-4参与了细胞凋亡调控.该信号转导途径对UVB诱导的细胞凋亡发挥正向作用.并最终导致繁殖力下降，即UVB具有显著的生殖毒性作用.

X51

A

1008-7974（2018）01-0047-05

10.13877/j.cnki.cn22-1284.2018.02.013

2017-11-02

安徽省教育厅青年人才基金项目（2012SQRL178）.

何梅，女，安徽长丰人，淮南师范学院生物工程学院讲师；罗勋，博士，副教授（安徽 淮南 232001）.

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