王 瑢 ，丁淑贤，王娟丽，鲍星星，边俊梅

(武汉市第三医院光谷院区，湖北 武汉 430074)

·论著·

2016年武汉地区住院儿童人博卡病毒感染的临床特征及流行病学

王 瑢 ，丁淑贤，王娟丽，鲍星星，边俊梅

(武汉市第三医院光谷院区，湖北 武汉 430074)

目的了解武汉地区住院儿童呼吸道人博卡病毒(HBoV)感染情况、临床特征及流行病学特点。方法收集2016年1—12月该院儿科因急性呼吸道感染的住院患儿968例，采用无菌负压吸引法采集新鲜标本检查痰HBoV、RSV、ADV、INF-A/B和PIV-I/II/III，分析HBoV感染病例的流行情况及临床特征。结果968例患儿中，HBoV阳性75例，检出率7.75%。男女患儿检出率分别为5.68%、2.07%，不同性别HBoV检出率比较，差异无统计学意义(χ2=2.083，P=0.140)；53例(70.67%)HBoV阳性患儿年龄<1岁，63例(84.00%)HBoV阳性患儿年龄<3岁，各年龄组检出率比较，差异有统计学意义(χ2=4.60，P=0.043)。春、夏、秋、冬HBoV检出率分别为9.78%、5.29%、2.86%、5.20%；除9、10月份外，HBoV在其余月份均有检出，3月份检出率最高(为33.33%)。17例单纯HBoV感染，58例混合感染，HBoV临床诊断以支气管肺炎为主(26例，占34.67%)。HBoV病例主要临床特征为发热(81.33%)、咳嗽和喘息(各占77.33%)。结论HBoV是武汉地区住院儿童呼吸道感染的重要病原体之一，全年均可发生HBoV感染，流行高峰在春季和夏季，无性别差异。住院儿童感染HBoV临床诊断以支气管肺炎最常见，主要表现为发热、咳嗽、喘息。

儿童； 呼吸道感染； 人博卡病毒； 临床特征

急性呼吸道感染(acute respiratory tract infection，ARTI)是引发婴幼儿疾病甚至死亡的主要诱因[1]，其常见病原体包括呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，RSV)、流感病毒(influenza virus，INF)、副流感病毒I—III型(parainfluenza virus，PIV-I/II/III)、冠状病毒(coronavirus，CV)、人偏肺病毒(human metapneumovirus，hMPV)、鼻病毒(rhinovirus，RV)及腺病毒(adenovirus，ADV)等[2-3]。人博卡病毒(human bocavirus，HBoV)是由瑞典科学家Allander等，于2005年10月从小儿下呼吸道感染分泌物中发现的一种新型细小病毒，该病毒能引起儿童下呼吸道感染，被命名为人博卡病毒[4]。之后，世界多个国家陆续在呼吸道感染患者中检测到该病毒。Vicente等[5]在患有胃肠炎的小儿类便中也检测到HBoV，同时在胃肠道疾病患者的粪便中又发现了3种不同基因型的HBoV(HBoV2、HBoV3和HBoV4)，证明HBoV不仅是小儿呼吸道感染的病原体，还会引发包括成人的病毒性肠胃炎[6-8]。近几年国内关于HBoV流行情况的报道[9]显示，北京检出率4.8%，西安6%，香港5%，重庆5.3%，福州5.8%和兰州1.4%。HBoV与其他病毒混合感染率较高，混合感染率最高的报道见于泰国(达90%)，而国内报道香港地区为19%，西安53.3%，兰州57.1%，重庆14.3%。由于不同区域地理、气候、环境等因素差异会引起不同呼吸道病毒感染，因此，本研究对武汉地区2016年1—12月因急性呼吸道感染住院患儿进行痰标本病原学检测，分析HBoV感染患儿的临床特征及流行病学特点，为本地区小儿呼吸道HBoV感染诊治提供数据支持。

1 对象与方法

1.1 研究对象 2016年1—12月武汉市第三医院因急性呼吸道感染住院的患儿968例，其中男性632例，女性336例，年龄1～84个月，年龄(19.31±5.67)个月。所有患儿均符合(诸福棠实用儿科学)(第七版)中急性呼吸道感染的诊断标准，患儿家属对本研究知情且签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 标本采集 患儿入院24 h内用无菌负压抽取痰标本，将无菌塑料导管经患儿鼻腔插入约7.5 cm到达咽部以下，吸取分泌物1～2 mL，置于无菌生理盐水中，搅动拭子数次，取出拭子，-70℃冰箱保存备用。

1.2.2 实时荧光PCR(RT-PCR)检测HBoV

1.2.2.1 标本预处理 标本送至实验室后先用吸管来回反复吹打，尽量将分泌物中的有形成分释放出来，后置 4℃离心机中离心，1 800 r/min,离心10 min，弃上清液，取细胞沉淀以提取病毒DNA。

1.2.2.2 标本病毒DNA提取 将采集到的鼻咽吸取物用pH 7.4 PBS进行洗涤，3 000 r/min离心5 min，取上清200 μL，加入裂解液200 μL(由达安集团提供)，95℃裂解10 min，再12 000 r/min离心5 min，上清为DNA模板，提取的病毒DNA -80℃冰箱保存备用(所有操作均按使用说明书进行)。

1.2.2.3 RT-PCR检测HBoV (1)设计引物。借鉴Gen Bank中已经发表的多种不同株HBoV全基因组序列，设计并且合成扩增HBoV的基因引物，所使用的引物、探针均采用生工生物工程(上海)股份有限公司的产品。序列见表1。(2) PCR 扩增。将DNA 3 μL，ddH2O 14.75 μL,RT缓冲液3 μL,MgSO42 μL,dNTP 1 μL,Taq酶0.25 μL,引物HBoV-F和R各0.5 μL，共25 μL加入PCR管中，然后加入RT-PCR自动循环仪中，循环条件为：50℃ 2 min, 95 ℃ 15 min，然后94℃ 15 s，55℃ 45 s，扩增40个循环。荧光曲线呈S型判断HBoV为阳性。

表1 HBoV引物和探针的设计序列

1.2.3 7种常见呼吸道病毒的检测

1.2.3.1 标本的处理 将痰加入离心管中，加入8 mL PBS缓冲液，震荡5 min，500 r/min离心10 min，弃上清，重复一次，然后向沉淀物中再加入适量的PBS缓冲液，使纤毛柱状上皮细胞浓度调整到1.0×106/mL。

1.2.3.2 细胞制片和染色 分别吸取上述7种柱状上皮细胞悬液25 μL点在7孔玻片上，室温晾干后采用4℃的丙酮固定10 min。将伊文斯蓝荧光素标记的7种常见呼吸道病毒单克隆抗体，即RSV、ADV、INF- A/B型和PIV-I/II/III单克隆抗体混悬液分别滴入标本上，37℃孵育30 min，PBS冲洗3次，再用蒸馏水清洗，室温干燥、封片。

1.2.3.3 阳性判断 呼吸道病毒细胞呈阳性时，荧光显微镜观察其背景为淡蓝色，且细胞的胞浆内和/或细胞核可看到黄绿色的荧光，而抗原阴性的细胞则无荧光。一般一孔涂片中含有>200个细胞，且表现为细胞内染色阳性细胞超过2%以上者，考虑为RSV、ADV、INF-A/B型和PIV-I/II/III型，而腺病毒和流感病毒则显示为核染色或浆内染色。以试剂盒提供的阳性和阴性对照片作为对照。

1.2.4 痰肺炎支原体DNA(MP-DNA)的检测 将痰标本离心弃上清，向沉淀物中加入DNA裂解液进行MP-DNA的提取，进行PCR扩增，引物和探针均来源生工生物工程(上海)股份有限公司。所使用的探针于特异杂交荧光探针的5’端结合荧光发光基团(FAM)，3’端结合荧光吸收基团(TAMRA)。取上清2 μL，8 000 r/min离心数秒后，置于仪器槽中。循环条件：93℃ 2 min→93℃ 45 s→55℃ 60 s 循环10次，93℃ 30 s→55℃ 45 s循环30次。荧光采集：55℃ 45 s。荧光定量以Ct值判定：(1) Ct值为30时，判定为阴性;(2)Ct值<30时，则判定为阳性。

2 结果

2.1 HBoV阳性情况 2016年1—12月共检测标本968例， HBoV阳性标本75例，其中男性55例，女性20例，总检出率7.75%，男女检出率分别为5.68%、2.07%。不同性别之间HBoV检出率比较，差异无统计学意义(χ2=2.083，P=0.140)。

2.2 不同年龄组患儿HBoV检出情况 53例(70.67%)HBoV阳性患儿年龄<1岁，63例(84.00%)HBoV阳性患儿年龄<3岁。各年龄组检出率比较，差异有统计学意义(χ2=4.60，P=0.043)。见表2。

表2不同年龄组患儿HBoV检出情况

Table2Detection result of HBoV in children of different age groups

年龄组(个月)检测标本数HBoV阳性例数检出率(%)0～341329．386～275217．6412～132107．5836～9888．1660～7633．9572～844612．17合计968757．75

2.3 不同季节HBoV检出情况 春、夏、秋、冬四季HBoV检出率分别为9.78%、5.29%、2.86%、5.20%，其中春季(2、3、4月)HBoV检出率处高峰期，各季节检出率比较，差异无统计学意义(χ2=7.697，P=0.053)。见表3。2016年9、10月HBoV检出率为0，在3月检出率最高(为33.33%)，2016年各月份HBoV的检出情况见图1。

表3 不同季节患儿HBoV检出情况

图1 2016年不同月份患儿HBoV检出情况

2.4 HBoV合并其他常见呼吸道病毒混合感染情况 混合感染患者58例，双重混合感染中以RSV+HBoV最常见(占53.45%，31例)，其次为INF-A+HBoV(占12.07%，7例)、ADV+HBoV(占10.34%，6例)、PIV-III+HBoV(占8.62%、5例)、INF-B+HBoV(占5.17%，3例)、PIV-I+HBoV和PIV-II+HBoV(各占1.72%，各1例)；三重混合感染RSV+INF-A+HBoV占1.72%(1例)，RSV-INF-B+HBoV占5.17%(3例)。

2.5 HBoV病例的临床诊断 支气管肺炎26例，占34.67%；喘息性支气管肺炎12例，占16.00%；急性毛细支气管炎和大叶肺炎各7例，各占9.33%；重症肺炎6例，占8.00%；急性上呼吸道感染和支气管炎各5例，各占6.67%；疱疹性咽峡炎3例，占4.00%；急性喉炎和间质性肺炎各2例，各占2.67%。

2.6 单纯HBoV阳性病例的临床诊断 75例HBoV阳性病例中，单纯HBoV感染者17例，其中支气管肺炎6例，占35.29%；急性上呼吸道感染和喘息性支气管肺炎各3例，各占17.65%；急性毛细支气管炎2例，占11.76%；急性支气管炎、大叶性肺炎和重症肺炎各1例，各占5.88%。

2.7 HBoV阳性病例临床特征

2.7.1 发热 61例(81.33%)患儿出现不同程度低、中和高热。见表4。<36个月的患者容易发热，且多数在38℃以上。不同年龄组发热情况差异有统计学意义(χ2=3.966，P=0.046)。

2.7.2 咳嗽、喘息 58例(77.33%)患儿有不同程度的咳嗽，其中主要以湿咳84.48%(49/58)为主，其次为干咳%(10.34%，6/58)、咳后有鸡鸣样回声(5.17%，3/58)。各年龄组差异有统计学意义(χ2=12.172，P=0.033)。58例(77.33%)患儿有喘息症状。各年龄组患儿喘息率比较，差异无统计学意义(χ2=2.672，P=0.975)。见表5。

表4 不同年龄组HBoV患儿发热情况[例(%)]

表5不同年龄组HBoV患儿咳嗽和喘息情况 [例(%)]

Table5Cough and wheezing in children of different age groups with HBoV infection(No. of cases[%])

年龄组(个月)病例数咳嗽喘息0～3228(87．50)23(71．88)6～2118(85．71)16(76．19)12～106(60．00)9(90．00)36～83(37．50)6(75．00)60～32(66．67)3(100．00)72～8411(100．00)1(100．00)合计7558(77．33)58(77．33)

3 讨论

急性呼吸道感染是儿童感染性疾病中最常见的疾病之一，主要包括支气管炎、肺炎和毛细支气管炎等。不同季节、年龄段和地区存在的病毒感染种类不同[10]。HBoV作为一种新的病原体，是对呼吸道感染病毒病原谱的重要补充。由于其在上呼吸道感染中占有一定的比例，特别是能引起严重的下呼吸道感染，因此引起各国科学家和临床工作者的高度重视。Edner等[11]发现，高滴度HBoV感染易引起呼吸道感染。尹芳等[12]发现，高病毒载量患儿喘息发作频率高于低病毒载量者。Zhou等[13]发现，HBoV单纯感染与混合感染之间引起的临床症状无显著性差异，但单纯HBoV感染有更高的病毒载量。目前，HBoV病毒分子生物学与流行病学研究方面已取得一定的成就。不同国家HBoV检出率有一定的差异，但大致在5%～10%[14]。该病毒引起的呼吸道感染主要机制以及更大范围的流行病学资料等还需进一步深入研究。王雅静等[15]研究发现，INF是广东省4年内人群发热呼吸道综合征的主要病毒性病原体，有季节分布规律(2～3月、7～8月和11～12月高发)和年龄分布规律(在<1岁的婴儿中高发)，但没有明显的性别分布差异。ADV、RSV、PIV、MPV和HBoV此5种病毒的检出率均没有明显的季节分布规律和性别差异，但有年龄分布特征: ADV 在<1岁的婴儿中高发，RSV、PIV、MPV和HBoV 4种病毒均在1～2岁的幼儿中高发，且7种病毒均存在交叉感染现象，HBoV的交叉感染率最高，INF的交叉感染率最低。张雪清等[16]检测2 425例患儿中有552例7种呼吸道病毒阳性，其中PIV-Ⅲ 感染是小儿呼吸道病毒感染的主要病毒，≤3岁的患儿呼吸道病毒感染率最高，以冬季为呼吸道病毒感染高发期。王娟丽等[17]研究发现，HBoV是武汉地区重症呼吸道感染患儿的主要病原体之一，一年四季均有可能发生感染，夏季和秋季感染率较高，半岁至3岁患儿感染率较高，且HBoV容易和其他病原菌发生混合感染。王维等[18]报道，天津地区部分儿童的急性呼吸道感染可能与HBoV感染相关，且HBoV感染在6～36月龄的婴幼儿中更常见，夏季为流行高峰。本研究HBoV的检出率为7.75%，高于前言中报道的结果。除9～10月外，HBoV在其余月份均有检出，其中HBoV在3月份检出率最高(为33.33%)。HBoV在春季(2、3、4月)检出率处于高峰期，与前期报道的夏、冬季存在差异。17例单纯HBoV感染中，主要诊断为支气管肺炎。HBoV感染病例的主要临床表现为发热、咳嗽和喘息。

综上所述，本研究对武汉地区住院儿童呼吸道感染HBoV进行了流行性分析，认为HBoV是引起武汉地区住院儿童呼吸道感染的重要病原体之一。全年均有HBoV感染的发生，流行高峰在春季和夏季，无性别差异。住院儿童感染HBoV临床诊断以支气管肺炎最常见。临床表现主要为发热、咳嗽、喘息。了解该地区呼吸道感染儿童病毒检出情况及患儿实验室诊断指标及预后情况等方面，有利于客观地评价HBoV的病原学特点，对临床医生诊断和治疗疾病具有重要的参考价值。

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ClinicalandepidemiologicalfeaturesofhumanBocavirusinfectioninhospitalizedchildreninWuhanarea

WANGRong,DINGShu-xian,WANGJuan-li,BAOXing-xing,BIANJun-mei

(GuangguBranchofWuhanThirdHospital,Wuhan430074,China)

ObjectiveTo understand infection status, clinical and epidemiological features of respiratory tract infection(RTI) with human Bocavirus(HBoV) in children in Wuhan area.MethodsA total of 968 hospitalized children with acute RTI between January and December 2016 were recruited in the study. Sputum specimens were collected by sterile negative pressure suction method. HBoV, respiratory syncytial virus, adenovirus, A/B-type influenza virus, and parainfluenza virus I/II/III were detected, the prevalence and clinical features of HBoV infection were analyzed.ResultsAmong 968 cases, 75(7.75%) were positive for HBoV. The detection rates of HBoV in boys and girls were 5.68% and 2.07% respectively, there was no significant difference in the detection rate of HBoV between different genders(χ2=2.083，P=0.140)；53 (70.67%) HBoV-positive children were<1 year old, 63(84.00%) were<3 years old, there was significant difference in the detection rate among all age groups(χ2=4.60，P=0.043). The detection rates in spring, summer, autumn, and winter were 9.78%, 5.29%, 2.86%, and 5.20% respectively； except September and October, HBoV was found positive in the other months, detection rate was highest in March (33.33%). 17 cases were simple HBoV infection and 58 were mixed infection, the main clinical diagnosis of HBoV was bronchopneumonia(n=26, 34.67%). The main clinical features of HBoV cases were fever(81.33%), cough(77.33%), and wheezing (77.33%).ConclusionHBoV is one of the important pathogens causing RTI in hospitalized children in Wuhan area, HBoV infection can occur throughout the year , the peak season are spring and summer, there is no difference between different genders. The most common clinical diagnosis of HBoV in hospitalized children is bronchopneumonia, the main manifestations are fever, coughing, and wheezing.

child; respiratory tract infection; human Bocavirus; clinical feature

[Chin J Infect Control，2018，17(1)：31-35]

2017-03-30

武汉市卫生计生委医疗卫生科研项目(WG15D04)；湖北省卫生和计划生育委员会科研项目(WJ2017M186)

王瑢(1970-)，女(汉族)，湖北省武汉市人，副主任医师，主要从事儿科病毒感染性疾病的病原学研究。

边俊梅 E-mail：1012449894@qq.com

10.3969/j.issn.1671-9638.2018.01.007

R373.9 R725.6

A

1671-9638(2018)01-0031-05

李春辉、左双燕)