杨丰源 沈阳科技学院

甘草细胞生物反应器连续培养的探讨

杨丰源 沈阳科技学院

当今社会，生物反应器的种类越来越多，对于不同种类的植物，要采取不同的植物组织培养体系，设计适合这种植物的生物反应器，从而达到预期的培养效果。本文简单的介绍了甘草细胞在生物反应器中连续培养的过程，包括前期材料的准备，以及培养液中残糖的测定，得出了甘草细胞培养生长动力学和营养物质消耗动力学等相关结论，以供甘草细胞的生物反应器放大培养提供参考。

甘草细胞 生物反应器 残糖

甘草的药用在世界范围内有着悠久历史，而中国对于甘草的采集和药用历史更是长达将近五千年之久。甘草在中国传统医学领域中有着很高的地位，根据传统中医理论的相关记载，甘草可以使其他中草药的药用功效得到加强，所以在几乎所有的中医药方成分里都存在甘草。目前，由于甘草资源的减少，甘草行业面临着巨大的挑战，利用植物的组织培养技术和细胞培养技术对甘草进行大规模培养工作迫在眉睫。

1.材料和方法

1.1 前期材料的准备

甘草悬浮细胞系需要经过四次的悬浮继代培养，所培养出来的第四代甘草细胞可作为接种材料，应用在生物反应器之中，并选用自行研发设计出的连续搅拌式生物反应器系统，来实现甘草细胞的放大培养，同时还要选取已经除去连续给养系统之外的相同类型的生物反应器进行甘草细胞的培养。在对照培养方面，则要选取生长状态良好的摇瓶式培养。从甘草细胞进行接种的第一天开始，每隔三天进行一次取样，一直持续到培养工作完成为止。所取的样品要放在低温的环境中保存，以用于对培养液底物中糖、铵根离子、磷酸根离子、硝酸根离子浓度的测定。在每次进行取样的同时，还要使用JPBJ-608测定培养液的溶氧值，使用PHS-3C精密pH计测定培养液的pH值。所取的样品在经过低温离心处理之后，上层清液要收集并加以保存，下层使用滤膜进行真空抽滤处理，称量出样品的湿重，然后使用60摄氏度的烘箱烘烤24小时至恒重状态，称量出样品的干重。

1.2 培养液中残糖的测定

测定培养液中糖的残余量，首先要制备出标准曲线。取出50mg经过干燥处理的葡萄糖标准品，向其中加水使其成为1.0mg/mL的葡萄糖标准液。从中精密量取出0.1mL～1.0mL的标准液，并放置在10mL的容量瓶中，使用蒸馏水将其稀释到刻度线位置，摇匀之后精密取出1mL，放到刻度试管里，然后加5%苯酚液约1mL和5mL的浓硫酸，在室温状态放置40分钟，以1mL的蒸馏水、1mL的苯酚液、5mL的浓硫酸混合液根据上述的操作做空白。在UV-2201紫外可见分光光度计中，在490nm处测定出吸收度，对所测出的数据进行线性回归计算，回归方程是Y=9.533x-0.0141(R2=0.9916)。

2.结果与讨论

2.1 甘草细胞培养生长动力学

在液体培养基里面添加生长激素及褐化抑制剂的过程中，甘草悬浮细胞可以安全存活和生长，且生长的速度很快。同固体培养基中愈伤组织的生长情况相比，悬浮培养方式的延滞期要短很多。在固体培养基内，愈伤组织在生长时由于和培养基的接触面积相对较小，其传质的效率较低；而悬浮培养时的传质效率则要比愈伤组织高很多，其延滞期也相对较短。在摇瓶培养方式和生物反应器的批量培养方式中，随着悬浮培养细胞的进行，细胞的生物量也在不断增加，在培养液中的营养元素也会大量消耗掉，溶氧量越来越少，同时由于细胞在生长中逐渐出现破裂、消亡等状况，培养到后期之后存活的细胞生物量也会大量下降。

2.2 营养物质消耗动力学

细胞培养所使用的培养基在灭菌过程中，蔗糖由于受热会分解成葡萄糖和果糖，之后果糖会再次转化成葡萄糖，最终都是以葡萄糖的存在形式被植物细胞给吸收和利用。葡萄糖在进入到植物细胞中之后，一部分会成为细胞结构物质的组成部分，另一部分会由于呼吸作用成为能源和碳源以供细胞生命活动所用。在摇瓶培养和反应器分批培养的前21天，糖会逐渐被甘草细胞在代谢和生长过程中所吸收和消耗，细胞生物量会随之增加，培养基中的糖浓度也会随之减少，这些都体现出了碳源的重要性。造培养21天之后，糖的浓度开始呈现上升的趋势，这是由于部分细胞发生了自溶所导致的。在反应器进行连续灌注的培养中，糖浓度会在第六天到第十八天有一定幅度的降低，这说明这个时间段内糖的代谢速率在加快，这和甘草细胞生物量在快速积累有关。

综上所述，这种以过程的变量和参数恒定不变作为培养目的的操作方式，在甘草细胞的培养过程中能够以改变影响细胞生长的营养成分组成来对细胞代谢的活性变化和组成进行研究，这种稳定形态的甘草细胞也能根据质量的平衡来给培养过程中反应动力学的速率及参数测定提供便捷。研究人员们需要继续在甘草细胞的生物反应器培养工作进行放大实验，从而给甘草的大规模生产提供帮助。

[1]李雅丽，孟婷婷，王毛毛，李晓雪，李蓉蓉，郭晓强.甘草细胞在搅拌式生物反应器中的放大培养[J].植物生理学报，2015，51(03):302-306.(2015-03-24)[2017-08-17].

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