郑丽君,申光辉,张志清,代博仁,陈安均,黎杉珊,吴贺君,罗擎英

(四川农业大学 食品学院，四川 雅安，625014)

免泡豆杆优势腐败菌腐败能力及产生物胺特性分析

郑丽君,申光辉,张志清,代博仁,陈安均,黎杉珊,吴贺君,罗擎英

(四川农业大学 食品学院，四川 雅安，625014)

为考察4株优势芽孢杆菌对真空包装免泡豆杆致腐败能力差异及其产生物胺特性，通过分析接种优势芽孢杆菌免泡豆杆贮藏过程中豆杆样品菌落数量变化、产品感官品质、挥发性盐基氮(TVB-N)及生物胺含量变化，比较不同优势腐败菌对免泡豆杆品质的影响，分析样品菌落总数、感官评分及TVB-N值与生物胺相关指标间的相关性。结果表明，接种4株优势芽孢杆菌明显缩短了免泡豆杆货架期，25 ℃贮藏条件下货架期缩短至4天。在贮藏第8天，接种样品菌落总数高达10.82 ～10.95 lgCFU/g，TVB-N值为40.82～77.13 mg/100g。接种2株解淀粉芽孢杆菌样品总生物胺含量显著高于2株枯草芽孢杆菌，各接种样品中腐胺、尸胺含量高于其他生物胺，是腐败过程中的2种主要生物胺；其中接种解淀粉芽孢杆菌DY1b样品TVB-N产量因子YTVB-N/CFU、贮藏第8天总生物胺含量分别为2.49×10-9mg/CFU和1 087.54 mg/kg，均显著高于其他3株腐败菌。相关性分析表明，各生物胺指标与感官评分呈负相关关系(r=-0.884～-0.996)，与菌落总数、TVB-N值均呈正相关(r=0.514～0.991)。综上所述，解淀粉芽孢杆菌DY1b是真空包装免泡豆杆致腐能力最强的菌株，总生物胺含量是免泡豆杆腐败进程的重要指标。

芽孢杆菌；腐败能力；挥发性盐基氮；生物胺；相关性分析

豆杆是川渝地区的一种传统非发酵豆制品，烹调前需常温下浸泡复水2～4 h，食用极不方便。真空包装免泡豆杆是将传统豆杆制品复水，真空包装杀菌制备的一种开袋即食新型豆制品。由于免泡豆杆富含大豆蛋白、脂肪及碳水化合物等营养物质，且水分含量高，非常适宜腐败微生物生长繁殖，尤其是残留其中的耐热性芽孢杆菌[1]，导致产品出现涨袋、发黏、发臭等腐败变质现象，货架期较短，严重影响产品品质安全与销售。芽孢杆菌是豆腐、豆腐干等非发酵豆制品的主要腐败微生物[2-4]。本课题组利用选择性培养基从真空包装免泡豆杆腐败终点样品中分离获得4株优势腐败菌，经鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)和枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)。目前对豆制品腐败过程中的腐败因子及腐败代谢产物分析研究较少。本文主要将前期分离自腐败免泡豆杆中的4株优势芽孢杆菌接种至无菌免泡豆杆中，比较真空包装免泡豆杆25 ℃贮藏过程中微生物生长、产品感官品质、挥发性盐基氮(TVB-N)值变化，分析不同优势腐败菌代谢产生的生物胺种类与含量，并分析生物胺与其他指标间相关性，明确免泡豆杆腐败微生物的致腐能力差异，探讨特征生物胺指标作为贮藏期免泡豆杆品质变化指示指标的可行性，以期为免泡豆杆优势腐败菌的控制，延长免泡豆杆货架期，降低产品食用安全风险提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

优势腐败菌株：解淀粉芽孢杆菌DY1a、DY1b，枯草芽孢杆菌DY2a、DY3，保存于四川农业大学食品学院。

豆杆：四川山古坊食品有限责任公司提供。

主要试剂： PCA培养基，购自青岛海博生物技术有限公司；福林酚试剂，北京索莱宝科技有限公司；色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、组胺、酪胺、亚精胺及丹磺酰氯购自美国Sigma公司；乙腈、甲醇、丙酮，色谱纯，购自Oceanpak公司。

1.2 主要仪器

CPA225D型电子天平，德国赛多利斯公司；SHP-160生化培养箱，上海三发科学仪器有限公司；YXQ-LS-50SII立式压力蒸汽灭菌器，上海博讯实业有限公司；DZ400/2C真空包装机，上海青葩包装机械有限公司；KH-50B型超声波清洗器，昆山禾创超声仪器有限公司；ST16R冷冻离心机，美国赛默飞世尔科技；Milli-Q型超纯水纯化系统，美国密理博公司；LC-2010CHT高效液相色谱仪，日本岛津公司。

1.3 腐败菌菌悬液制备与样品接种处理

将分离菌株接种于无菌LB液体培养基中，37 ℃ 200 r/min 振荡培养12 h，调节菌悬液浓度为106CFU/mL备用；取干制豆杆用无菌水于20～23 ℃水温下浸泡复水4 h后，采用真空包装，每袋80 g样品，经15 min-20 min-10 min/121 ℃高温杀菌处理，获得无菌免泡豆杆(无菌落检出)。将无菌免泡豆杆置于供试菌株菌悬液中浸泡30 s，取出后用无菌包装真空包装，即为接种处理免泡豆杆，以无菌水浸泡30 s，无菌真空包装的豆杆为对照样品。所有样品于25 ℃下贮藏，每隔2天采集样品，测定菌落总数，并进行感官评价，测定挥发性盐基氮值及7种生物胺含量，以评价4株芽孢杆菌对免泡豆杆的腐败能力。

1.4 感官评价

参考陈平等[5]对豆干的感官评价方法，由10人组成的感官评价小组按表1从色泽、气味、质地方面对实验豆杆样品进行感官评价。

表1 免泡豆杆样品感官评价标准Table 1 Criteria for sensory evaluation of rehydration dougan

1.5 菌落总数和挥发性盐基氮测定

参照GB4789.2—2010[6]对样品进行细菌菌落总数测定。参照GB 5009.228—2016[7]测定挥发性盐基氮(TVB-N)。

1.6 生物胺测定

1.6.1 样品处理、生物胺标准溶液的配制及衍生

将样品通过均质、提取，并采用丹磺酰氯丙酮溶液进行衍生处理后过滤，具体处理参考巩洋[8]等的方法，每样品重复3个。用 0.1 mol/L HCl分别配制质量浓度为1 mg/mL的色胺(Try)、苯乙胺(Phe)、酪胺(Tyr)、组胺(His)、腐胺(Put)、尸胺(Cad)、亚精胺(Spd)7种生物胺单标储备液，4 ℃避光保存。取7种生物胺单标储备液，稀释成质量浓度为0.5、1.0、2.0、2.5、5.0、10 μg/mL的生物胺混标溶液，进行丹磺酰氯丙酮溶液衍生处理。

1.6.2 HPLC测定条件

采用Phenomenex Luna C18(2)色谱柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相A为超纯水，流动相B为乙腈，梯度洗脱条件为：0～5 min，35%流动相A，65%流动相B；5～25 min，30%流动相A，70%流动相B；25～30 min，35%流动相A，65%流动相B；柱温30 ℃，流速1.0 mL/min，进样量10 μL，采样时间30 min，检测波长为254 nm。

1.7 生物胺相关指标的计算

单胺(momoamine，MA)= Try+Phe+Tyr+His(mg/kg)

二胺(Diamine，DA)= Put+Cad(mg/kg)

生物胺指数(Biogenic amine index，BAI)= His+Put+Cad+Tyr(mg/kg)

总生物胺(Total biogenic amine，TBA)= Try+Phe+Tyr+His+Put+Cad+Spd(mg/kg)

1.8 腐败菌产挥发性盐基氮的定量分析

把达到感官拒绝点时单位腐败菌产生挥发性盐基氮(TVB-N)值的量，即TVB-N产量因子YTVB-N/CFU作为腐败菌产生物胺能力评价的定量指标[9]。

式中：YTVB-N/CFU为TVB-N产量因子,mg/CFU；N0为初始菌数,lgCFU/g；NS为腐败时的腐败菌数,lgCFU/g；(TVB-N)0、(TVB-N)S为初始和腐败时的TVB-N值。

1.9 数据处理

使用SPSS 22.0 和Excel 2010 软件进行数据显著性分析，进行相关性分析，Origin 8.0 软件作图。

2 结果与分析

2.1 真空免泡豆杆贮藏期间菌落总数变化

微生物指标是评价产品品质和安全性的重要指标。由图1可见，未接菌豆杆样品经121 ℃，20 min灭菌处理后，未检出菌落(第0天)，表明该条件能够彻底杀灭菌体细胞；但对照样品在贮藏至第2天检出菌落，且菌落总数随着贮藏时间的延长而不断增加，这可能与样品残留有耐热性极强的细菌芽孢，在杀菌处理后，芽孢逐渐萌发形成菌体细胞并繁殖增加有关，即处理结束后仍残留有耐热性细菌芽孢。未接菌对照样品在贮藏期内芽孢逐渐萌发，样品菌落数量也不断增加，菌落总数在贮藏至第2天已达4.5 lgCFU/g，贮藏第4天时达到6 lgCFU/g，但其数量显著低于接菌样品(图1)。接种4株芽孢杆菌免泡豆杆的菌落总数增长趋势一致，贮藏期间各接菌样品菌落总数无显著性差异，但其菌落总数均显著高于未接菌对照样品。随贮藏时间延长，各接菌免泡豆杆菌落总数从贮藏第2天起开始迅速增长，至第6天菌落总数已达10 lgCFU/g；贮藏至第8天时由于免泡豆杆中营养物被消耗减少，生物胺等腐败代谢产物积累，微生物增长速度逐步趋于稳定[10]。

图1 接种4株腐败菌免泡豆杆贮藏期间菌落总数变化Fig.1 Total aerobic bacterial counts of rehydration dougan inoculated with four spoilage bacteria during storage at 25 ℃

2.2 真空免泡豆杆贮藏期间感官评价结果

腐败微生物可加速蛋白质等营养物质的降解，致使豆制品[5]出现色泽暗淡、弹性下降、散发胺臭味等腐败变质现象。由图2可见，豆杆样品感官评分随着贮藏时间均呈现明显的下降趋势，且接菌样品感官评分显著低于未接菌对照样品。接菌样品在贮藏至第2天时，豆香味逐渐变淡，色泽、质地开始显现腐败现象。而第4天时，接种解淀粉芽孢杆菌DY1a和DY1b的样品感官评分已低于50分，腐败程度加重，感官无法接受。贮藏至第6天时，各接菌样品腐败程度进一步加剧，样品出现色泽暗淡，质地软烂，散发严重胺臭味，感官评分均降低至30分以下，此时样品已完全腐败。同时，未接种对照样品也在贮藏至第6天时表现出腐败特征。

图2 接种4株腐败菌免泡豆杆贮藏期间感官评价Fig.2 Sensory evaluation changes of rehydration dougan inoculated with four spoilage bacteria during storage at 25 ℃

2.3 挥发性盐基氮(TVB-N值)

豆制品、肉类等富含蛋白质的食品，主要以蛋白质分解作为其腐败变质的特征，TVB-N是腐败微生物降解蛋白质的重要产物，是评价高蛋白食品新鲜程度的重要指标[11]，其值越高则表明样品蛋白质降解腐败程度越高。由图3可见，各接菌样品与未接菌样品的TVB-N值在贮藏期间呈上升趋势，贮藏末期接种菌株DY1b的样品TVB-N值显著高于其他接菌样品，各接菌样品TVB-N值显著高于未接菌样品。在贮藏期第2天时，接菌样品TVB-N值开始增加，接种DY2a的样品TVB-N值达到了31.86 mg/100g，这说明此时接种菌株DY2a的样品已经腐败[12]。贮藏至第4～6天时，接种DY3的样品TVB-N值出现上升趋于稳定状态，这可能是因为含氮性物质的累积从而能抑制了含氮性物质的形成，导致其增长速度减缓，这与黄林[13]，黎园园[14]等研究肉中腐败微生物生长及TVB-N产生状况基本一致。从第4天开始，接种DY1b的样品TVB-N值高于其余接菌样品，这可能是由于不同微生物蛋白酶产生量与活力不同，而导致蛋白质降解生成TVB-N含量不同[15]，使TVB-N值含量有所差异，说明DY1b致腐败能力最高，其余依次是DY2a、DY1a、DY3。

图3 接种4株腐败菌免泡豆杆贮藏期间TVB-N值变化Fig.3 Total viable basic nitrogenvalues of rehydration dougan inoculated with four spoilage bacteria during storage at 25 ℃

2.4 真空免泡豆杆贮藏期间生物胺种类及含量变化

生物胺是一类具有生物活性的低分子量含氮有机物，是食品腐败微生物分解蛋白质经脱羧产生的一类重要代谢产物，按其合成途径可分成单胺(如酪胺、苯乙胺、组胺、色胺)、二胺(如腐胺、尸胺)和多胺(如精胺、亚精胺)，其中单胺中组胺、酪胺毒性最强，二胺中的腐胺和尸胺会增强组胺和酪胺的毒性[16]。不少研究将生物胺的变化作为评价水产品、肉品等富含蛋白质食品腐败的关键指标[17-18]。图4为贮藏过程7种生物胺及总生物胺的变化情况。接种4种优势腐败菌豆杆样品中7种生物胺及总生物胺含量随着贮藏时间的延长而逐渐增加，并且显著高于未接菌对照样品。贮藏前期各生物胺含量呈缓慢上升，至第6～8天时含量急剧上升。

在贮藏期内，不同优势芽孢杆菌产生物胺种类及其数量不同。由图4A、图4B可见，接种解淀粉芽孢杆菌的样品色胺与苯乙胺含量增长速度显著高于接种枯草芽孢杆菌的样品。贮藏前期(0～4 d)4组样品色胺含量上升趋势一致，接种DY1a的样品在第6天时含量突增至122.96 mg/kg，贮藏末期趋于平缓，含量仍为最高，其次是DY1b。到第4天时接种解淀粉芽孢杆菌DY1a，DY1b的样品中苯乙胺远含量已超过报道的在食品中致毒剂量30 mg/kg[19]，第8天时接种菌株DY1b的样品达196.95 mg/kg。

图4 接种4株腐败菌免泡豆杆贮藏期间7种生物胺及总生物胺含量变化Fig.4 The contents of biogenic aminesin rehydration douganinoculated with four spoilage bacteria storaged at 25 ℃

腐胺和尸胺分别由鸟氨酸和赖氨酸脱羧而成的具有腐臭气味的化合物，将严重影响产品风味，由图4C和D可知，两种生物胺在贮藏前中期(2～6 d)上升缓慢，至第 8天时产生量快速增长并高于其他种类生物胺，其中接种菌株DY1b的样品产腐胺、尸胺能力最强，其含量显著高于其他样品，分别为：281.33 mg/kg和242.57 mg/kg。

组胺在生物胺中毒性最大，由图4E可见，接种菌株DY2a的样品产组胺能力最强，产量在第8天显著高于其他接菌样品，为126.76 mg/kg，而接种菌株DY3的样品组胺含量最低46.02 mg/kg。图4F显示，接种枯草芽孢杆菌的样品酪胺产量较高，其中接种菌株DY3的样品最高115.06 mg/kg，已超过食品中推荐上限100 mg/kg[20]，而接种菌株DY1b的样品仅有66.71 mg/kg。

接种DY1a样品亚精胺含量最高，为157.44 mg/kg，其他接种样品亚精胺含量由大到小依次为接种DY3、DY2a、DY1b(图4G)。由图4H可见，贮藏至第8天时，接种解淀粉芽孢杆菌DY1a、DY1b的样品总生物胺含量最高，分别为1 048.95 mg/kg、1 087.54 mg/kg，显著高于接种枯草芽孢杆菌DY2a、DY3的样品(总生物胺含量分别为827.17 mg/kg、750.47 mg/kg)。

总体比较发现，贮藏过程解淀粉芽孢杆菌降解豆杆蛋白生成的总生物胺含量最高，其中腐胺、尸胺的含量相对较高，这与杨筱珍等[21]研究结果相似，但与豆瓣酱[22]及酱油[23]等发酵豆类制品研究结果不同。

2.5 优势腐败菌致腐败能力的定量分析

腐败产物的产量因子是评价腐败菌腐败能力的重要指标。本实验以腐败样品中挥发性盐基氮的产量因子YTVB-N/CFU作为优势芽孢杆菌致腐能力的评价指标。由表2可见，2株解淀粉芽孢杆菌(DY1b、DY1a)YTVB-N/CFU高于2株枯草芽孢杆菌(DY2a、DY3)，其中DY1b的YTVB-N/CFU最高，其值为2.49×10-9mg TVB-N /CFU，分别是菌株DY1a、DY2a、DY3的1.12、2.51、1.04倍，表明解淀粉芽孢杆菌DY1b的致腐能力最强。不同腐败菌株腐败能力差异可能与氨及胺类等碱性含氮物质产生有关的蛋白水解酶及氨基酸脱羧酶的活性有关[24]。

表2 接种不同菌株的免泡豆杆贮藏期间致腐因子比较Table 2 Comparsion of the yield factors of TVB-N of rehydration dougan inoculated with spoilage bacteria during storage

2.6 接种豆杆生物胺指标与菌落总数、感官评分、TVB-N值相关性分析

食品贮藏过程中生物胺含量变化与其感官及品质指标密切相关，可作产品鲜度的评价指标[25]。由表3可知，4株腐败菌生物胺的产生与菌落总数密切相关。接种DY1a样品除酪胺(r=0.869，p>0.05)外，其他生物胺指标与菌落总数之间均有较高相关性，其中苯乙胺、尸胺与菌落总数呈极显著相关(r分别为0.970，0.967，p<0.01)；接种DY1b样品生物胺指标与菌落总数之间均有较高相关性，其中色胺、苯乙胺、组胺、酪胺、单胺、BAI、总生物胺与菌落总数呈极显著相关(r为0.962～0.991，p<0.01)，腐胺、尸胺、亚精胺和二胺与菌落总数呈显著相关(r为0.921～0.956，p<0.05)；接种DY2a样品二胺、BAI、总生物胺与菌落总数极显著相关(r分别为0.989，0.989和0.985，p<0.01)；接种DY3样品除尸胺(r=0.859，p>0.05)外，其他生物胺指标与菌落总数均呈显著相关，其中总生物胺与菌落总数也呈极显著相关(r=0.992，p<0.01)。

表3 接种腐败菌豆杆样品菌落总数、感官评分、TVB-N值与生物胺指标的相关性Table 3 Coefficient among the total bacteria counts, sensory quality, TVB-N values and biogenic amines of rehydration douganinoculated with four spoilage bacteria strains

注：*表示差异显著(p<0.05)；**表示差异极显著(p<0.01)。

由表3知，接种4株腐败菌样品的生物胺指标与感官评分也呈现良好负相关性。其中接种DY1a样品酪胺与感官评分相关性较低(r=-0.885，p>0.05)，其他生物胺指标与感官评分均有较高相关性，其中色胺、尸胺、组胺、二胺、单胺、TBA、BAI与感官评分呈极显著负相关(r=-0.974～-0.961，p<0.01)；接种DY1b样品生物胺指标与感官评分间呈良好的负相关(r=-0.909～-0.994)，其中色胺与感官评分相关性最高(r=-0.994)；与接种DY1a样品类似，接种DY2a样品酪胺也与感官评分相关性较低，(r=-0.874，p>0.05)，色胺与感官评分相关性最高(r=-0.996，p<0.01)；接种菌株DY3样品尸胺与感官评分相关系数较低(r=-0.884，p>0.05)，其他生物胺指标与感官评分均呈显著相关，其中总生物胺与感官评分相关性最高(r=-0.982，p<0.01)。

挥发性盐基氮包含样品腐败过程由蛋白质分解产生的氨及胺类等碱性物质，为生物胺的形成提供了良好的氨基酸前体物质。由表3可知，各接种样品生物胺指标与TVB-N值相关性较高。接种DY1a的样品中色胺与TVB-N值相关性最高(r=-0.934，P<0.05)，酪胺最低(r=0.812，P>0.05)，其他生物按指标与TVB-N值相关性也较高(r>0.885，p<0.05)。接种DY1b样品生物胺指标与TVB-N值具有较高相关性(r=0.933～0.991)，其中色胺和腐胺与TVB-N值相关性最高。而接种菌株DY2a、DY3样品生物胺指标与TVB-N值相关性较低，在接种菌株DY2a样品中r分别为0.514～0.745，p>0.05；接种菌株DY3样品中组胺与TVB-N值相关性最高(r=0.968，p<0.01)，色胺其次(r=0.953，p<0.05)，其余生物胺相关指标与TVB-N值相关性较低(r<0.832，p>0.05)。

ROKKA[26]和王真真[27]等研究将与菌落总数相关系数大于0.9的生物胺含量作为肉品腐败的指示指标，由于本实验样品贮藏过程将存在多种菌株，综合考虑将总生物胺作为评价免泡豆杆的腐败指标及生物胺安全性可能更适用。

3 结论

本研究通过比较接种腐败菌的真空包装免泡豆杆25 ℃贮藏过程中微生物数量，豆杆感官品质及主要生物胺的变化发现：4株优势腐败芽孢杆菌均可在免泡豆杆中迅速繁殖，并通过蛋白酶水解蛋白质，产生大量挥发性盐基氮物质，导致免泡豆杆感官品质下降，同时不断积累7种生物胺；通过TVB-N产量因子YTVB-N/CFU及总生物胺含量比较分析，解淀粉芽孢杆菌DY1b对免泡豆杆的致腐败能力最强，其次是解淀粉芽孢杆菌DY1a和枯草芽孢杆菌DY2a、DY3；相关性分析表明，DY1b菌落总数与各生物胺指标呈较高的相关性，其中总生物胺含量变化可客观反映接种优势腐败菌的豆杆腐败变质进程，可作为判断产品腐败品质变化重要的指标，为产品货架期的预测和质量的控制提供依据。

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EvaluationofthespoilagepotentialofspecificBacillusbacteriainvacuum-packedrehydrationdouganandcharacteristicofproducingbiogenicamines

ZHENG Li-jun, SHEN Guang-hui*, ZHANG Zhi-qing, DAI Bo-ren, CHEN An-jun,LI Shan-shan, WU He-jun, LUO Qing-ying

(College of Food Science, Sichuan Agricultural University, Ya'an 625014, China)

To explore the spoilage abilities of four specific spoilageBacillusspp. and the characteristic of producing biogenic amines. The total bacteria counts,sensory quality, total volatile basic nitrogen (TVB-N) and biogenic amine of samples inculated with spoilage strains respectively were assayed to evaluate the spoilage abilities, and correlation among the total bacteria counts, sensory quality, TVB-N values and biogenic amines during storage. Results showed that all of the dougan samples inoculated with fourBacillusspp. were spoiled noticeably after 4 days at 25℃. At day 8, the total bacteria counts reached 10.82-10.95 lgCFU/g, the TVB-N values were 40.82-77.13 mg/100g.The total biogenic amine content ofB.amyloliquefacienswas higher thanB.subtilis, putrescine and cadaverinecontents were higher than other biogenic amine in inculated samples. TVB-N yield factorYTVB-N/CFU, total biogenic amine in samples inoculated withB.amyloliquefacienDY1b at day 8, were 2.49×10-9mg/CFU,1 087.54 mg/kg, were significantly higher than the other threeBacillusspecies. Correlation analysis results showed that the biogenic amine indexes were negatively correlated with the sensory scores (r=-0.88--0.996), which were positively correlated with total bacterial counts and TVB-N values (r=0.514-0.991).B.amyloliquefaciensstrain DY1b was the main organism responsible for the rehydration dougan spoilage stored at 25 ℃. The total biogenic amine could be used as the spoilage indicators of rehydration dougan.

Bacillus; spoilage potential; total volatile basic nitrogen; biogenic amine; correlation analysis

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.014849

硕士研究生(申光辉博士为通讯作者,E-mail:shenghuishen@163.com)。

四川省教育厅川菜发展研究中心重点规划项目(CC2017Z01)；四川农业大学校企合作项目(060H0301)

2017-05-27,改回日期：2017-06-20