李京有，姜乃德，卜小琨

（滨州医学院附属烟台业达医院心胸外科，山东 烟台 264006）

Foxp3基因在肺癌并胸腔积液患者胸水中的表达及临床意义

李京有，姜乃德，卜小琨

（滨州医学院附属烟台业达医院心胸外科，山东 烟台 264006）

目的研究Foxp3基因在评估肺癌并胸腔积液患者胸膜转移的临床意义。方法分别检测肺癌并胸膜转移患者胸水中脱落细胞阳性率，通过RT-PCR法对肺癌并胸腔积液患者外周血、胸水Foxp3 mRNA水平进行检测。结果肺癌外周血及胸腔积液中Foxp3基因表达量明显升高；无论胸水脱落细胞是否阳性，胸膜转移患者胸腔积液中Foxp3 基因 表达量无明显差异，但较正常人外周血Foxp3表达量明显升高。结论肺癌并胸腔积液患者胸水中Foxp3基因表达水平有助于胸膜转移的评估，而且较胸水中脱落细胞检查更为敏感。

非小细胞肺癌；胸腔积液；Foxp3基因；胸膜转移；脱落细胞

胸腔积液是中晚期肺癌，尤其是非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）最易合并表现之一，根据第八版国际肺癌TNM分期，肿瘤胸膜播散为M1a，提示肿瘤已进展至局部晚期，不适宜手术治疗；研究[1]发现，肺癌胸腔积液超过一半为恶性，少数胸水并不是肿瘤对胸膜造成直接侵犯形成，这种被称为反应性积液。临床通常采用胸腔穿刺胸水脱落细胞检查来鉴别积液的良恶性，但其阳性率受多种因素影响，胸液癌细胞总阳性率40%-87%。还有研究表明，肺癌患者体内Foxp3+CD4+CD25+调节性T细胞的表达水平增高，介导了肿瘤患者的免疫抑制。本研究尝试通过检测肺癌并胸腔积液患者胸水中Foxp3基因的表达水平，评估和指导胸腔积液良恶性的鉴别，从而为术前肿瘤分期提供依据，将有助于治疗策略的正确选择。

1 资料与方法

1.1 研究对象 收集我院（烟台开发区业达医院）2010年-2016年肺癌合并胸腔积液患者102例，男性64例，女性48例；年龄43岁-78岁。研究对象102例，经手术、胸腔镜活检及胸水脱落细胞检查证实为肺癌并胸膜转移患者。除外伴有免疫相关性疾病的患者，全部患者标本选取之前都没有接受抗癌、免疫治疗，没有糖皮质激素使用史。胸部CT扫描发现伴有胸腔积液，胸水脱落细胞检查阳性79例；阴性23例，经手术或胸腔镜活检证实为胸膜转移。另选42例健康查体者为对照组，男性19例，女性23例；年龄22岁-73岁。

1.2 实验方法

1.2.1 方法 分别抽取肺癌患者和健康对照组外周新鲜静脉血液3 mL，用肝素抗凝。肺癌并胸腔积液患者经胸腔穿刺抽取胸水100 mL；分别检测Foxp3基因表达水平。

1.2.2 流程 将外周血、胸腔积液中单个核淋巴细胞分别通过淋巴细胞分离液（Ficoll）完成分离，选择PBS液进行2次洗涤。选取1 mL Trizol加入，提取总RNA。紫外分光光度计检测RNA浓度。 取样品RNA 1 μL进行逆转录反应合成cDNA。以cDNA为模板进行DNA扩增（PCR），将GAPDH当作内参照，如下详细说明实验需要用到的引物序列、反应条件、片段长度：Foxp3上、下游引物分别为5'-AGCAGCGGACACTCAATGAGAT-3’、5'-T T G C G G A A C T C C A G C T C A T C-3’，1 7 9 b p。G A P D H上、下游引物分别为5'-C T T A G C A C C C C T G G C C A A G-3'、5'-GATGTTCTGGAGAGCCCCG-3'，150 bp。具体反应条件如下：94oC下持续2 min，94oC下变性30 s， 60oC下退火30 s，72oC下进行1 min延长，一共进行40个循环。在120 mV 2%琼脂糖凝胶中加入PCR产物5 µL，进行大约30 min的电泳处理。电泳后将凝胶放在紫外光可见分析装置中实施扫描，结果图像通过软件分析，记录吸光度值，半定量Foxp3/GAPDH吸光度比值，每个标本进行2次重复，结果以平均值记录。

表1 各种患者的Foxp3+表达水平与对照组比较分析

1.3 统计学方法 采用统计学软件SPSS 19.0分析数据，计数资料采用率（%）表示，组间比较采用χ2检验；计量资料采用均数±标准差（Mean±SD）表示，组间比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

胸腔穿刺胸水脱落细胞检查阳性为79例，阳性率为77%；肺癌患者外周血及胸腔积液中Foxp3+表达量分别为（1.38±0.15）、（1.41±0.21），P＞0.05；对照组为（1.04±0.22），两两比较，P均＜0.05。说明肺癌患者外周血及胸膜转移患者胸腔积液中Foxp3的表达量较对照组外周血中Foxp3的表达明显升高；胸水脱落细胞阳性及阴性肺癌患者胸水中Foxp3+表达量分别为（1.41±0.36）、（1.42±0.32），P＞0.05；与对照组比较，P＜0.05。说明无论胸水脱落细胞是否阳性，胸膜转移患者胸）腔积液中Foxp3基因表达量无明显差异，但较正常人外周血Foxp3表达量明显升高，说明比胸水脱落细胞检查阳性率更高。

肺癌患者外周血及胸水中Foxp3+表达水平明显高于正常对照组；胸水脱落细胞阳性肺癌患者外周血Foxp3+表达水平与胸水脱落细胞阴性肺癌患者相比无差别。

3 讨论

肺癌导致的胸腔积液，并非全都是肿瘤直接侵犯胸膜（腔）所致，其形成可能有以下原因：肿瘤对胸膜造成直接侵犯，使得增加了胸膜表面通透性，导致阻碍了淋巴回流；肿瘤、淋巴结转移，肿块对淋巴管、血管形成侵犯或者压迫使得回流不畅，发生管腔渗漏造成；肿块对近端支气管造成阻塞形成肺不张、阻塞性肺炎进而出现胸腔积液；低蛋白血症、重度营养不良都可能导致出现漏出性胸腔积液等[2]。研究资料[3]表明，肺癌并胸腔积液患者有22%在胸膜上找不到肺癌转移的证据。临床上鉴别积液的良恶性，将有助于治疗策略的正确选择。

肺癌患者胸腔积液中Foxp3基因表达显著增高，表明Foxp3+CD4+CD25+调节性T细胞容易被趋化到胸腔积液，这与肿瘤组织中Foxp3+CD4+CD25+调节性T细胞增加的结果[4]一致。有报道称，大部分肿瘤细胞否可以进行CCL22趋化因子的分泌，另外，Foxp3+CD4+CD25+调节性T细胞表面高表达CCL22的受体CCR4[5]。考虑是肿瘤细胞经对CCL22分泌趋化CD4+CD25+调节性T细胞一直到肿瘤局部，这也是Foxp3+CD4+CD25+调节性T细胞易趋化到肺癌胸腔积液的机制之一。

积液性质确定的方法可以选择电视胸腔镜探查、胸腔穿刺胸水检验、胸膜活检、经皮胸膜活检等。常用的是胸水脱落细胞检查，胸腔积液细胞学检测确定癌细胞是诊断癌性胸腔积液的标准。不过多种因素都会对阳性率形成影响：（1）广泛的胸膜腔肿瘤侵犯使得出现恶性胸液，癌细胞确定更简单；（2）病理类型不同的恶性胸液癌细胞阳性率存在明显差异，肺鳞癌为4%-25%，肺腺癌为85%-100%；（3）复查次数、检验技术、取标本方法都可能影响阳性率，占40%-87%[6]。

我们的研究表明肺癌并胸膜转移患者胸水中的Foxp3+表达明显升高，较胸腔穿刺胸水脱落细胞检查更为敏感。 脱落细胞检查阴性且Foxp3+表达明显升高的患者慎重手术治疗，可反复送检胸水，查脱落细胞。必要时胸腔镜胸膜活检，提高胸膜转移的检出率。脱落细胞检查阴性且Foxp3+表达偏低的患者建议接受手术治疗。

联合胸水脱落细胞检查及检测肺癌患者外周静脉血及胸腔积液中CD4+CD25+调节性T细胞Foxp3+基因表达水平，用以评估胸水患者胸膜转移诊断，提高诊断阳性率。为临床分期、制定治疗方案提供参考。减少不必要的开胸手术治疗。

[1] 李宝珠, 卢春玲, 禹彩霞, 等. 非小细胞肺癌患者外周血Foxp3+调节性T细胞、Foxp3基因的表达及意义[J]. 广东医学, 2016, 37(22): 3410-3412.

[2] 郭净, 刘忠达, 张尊敬, 等. 非小细胞肺癌患者外周血CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞的研究[J]. 中国基层医药,2015, 22(4): 510-513.

[3] 曾庆哲, 张浩清, 杨瑞青, 等. Dickkopf-1在肺癌相关恶性胸腔积液中的表达和临床意义[J]. 中国医药导报, 2016, 13(8):108-111.

[4] 唐中豪, 李敏静, 陆运涛, 等. 老年患者肺癌恶性胸腔积液和肺炎旁胸腔积液中FoxM1基因表达差异分析[J]. 老年医学与保健, 2015, 21(1): 18-19, 45.

[5] 马秦榕, 郑锦花, 钟玲玲, 等. 肺腺癌患者胸水中肿瘤耐药相关基因蛋白的表达及临床意义[J]. 中国老年学杂志, 2016,36(13): 3193-3195.

[6] 韩娟, 颜浩, 张凌, 等. Twist蛋白、VEGF、CEA、CYFRA21-1、NSE在肺癌患者恶性胸水中的表达和应用[J].国际呼吸杂志, 2016, 36(8): 563-567.

Expression and clinical significance of Foxp3 gene in plural effusion of the lung cancer patients with plural effusion

Jingyou LI, Naide JIANG, Xiaokun BU
Department of Cardiothoracic Surgery, Yantai YEDA Hospital Affiliated to Binzhou Medical School,Yantai 264006, China

ObjectiveTo study the clinical significance of Foxp3 gene on evaluation of plural metastasis of the lung cancer patients with plural effusion.MethodsTo respectively detect the positive percentage of exfoliated cell in plural effusion of the lung cancer with plural metastasis, Foxp3 and mRNA levels in the peripheral blood and pleural fluid of patients with lung cancer and pleural effusion were detected by RT-PCR.ResultsThe expression of Foxp3 mRNA was higher significantly in preipheral blood and plural effusion in the lung cancer patients with plural effusion.Regardless of the positive exfoliated cell in plural effusion, the expression of Foxp3 mRNA had no significant difference in plural effusion of the patients with plural metastasis, but were higher significantly than that in peripheral blood of the normal control.ConclusionThe expression of Foxp3 gene in plural effusion contributes to evaluation of plural metastasis of the lung cancer patients with plural effusion, and was more sensitive than the detection of exfoliated cell in plural effusion.

Non-small cell lung cancer; Plural effusion; Foxp3 gene; Plural metastasis; Exfoliated cell