巴音额古乐 金鸿宾

(1.内蒙古国际蒙医医院，内蒙古 呼和浩特 010065；2.天津医院，天津 300211)

蒙药蓝刺头对骨折愈合影响的实验研究△

巴音额古乐1金鸿宾2

(1.内蒙古国际蒙医医院，内蒙古 呼和浩特 010065；2.天津医院，天津 300211)

目的：观察蒙药蓝刺头对骨折愈合的影响作用。方法选用健康成年日本大耳白兔75只，制作双侧桡骨中段骨折模型。实验随机分为模型组，阳性对照骨碎补组(0.3g·kg-1)，蒙药蓝刺头高、中、低剂量组(3g·kg-1、1.5 g·kg-1、0.3g·kg-1)，药物掺入饲料，于造模后d1连续给药8wk。分别于骨折后第 2、4、8wk时处死，并处死前取股动脉血，观察蒙药蓝刺头对骨折区域骨组织形态和血清相关骨代谢指标的影响。结果血清I型前胶原N末端前肽(PINP)、I型胶原C末端肽(CTX-1)检测显示，相同时间点内除PINP各组中的蒙药蓝刺头中剂量组和骨碎补组无差异外，其余各组均有显著差异(P<0.001)；不同时间点的PIPN和CTX-1在各组间均存在显著性差异(P<0.001)。X线片半定量评定，各组间比较显示，蒙药蓝刺头高剂量组在第2、4、8wk时与模型组、蒙药蓝刺头低剂量组比较具有统计学意义 (P<0.05)；骨碎补组和蒙药蓝刺头中剂量组在第2、4wk时与模型组比较具有统计学意义 (P<0.05)。进行骨折愈合组织学评价，各组间比较显示，各期蒙药蓝刺头高剂量组与模型组、蒙药蓝刺头低剂量组比较均有显著性差异(P<0.01)；蒙药蓝刺头中剂量组、骨碎补组在第2、4、8wk时与模型组比较也具有显著性差异(P<0.01)。结论蒙药蓝刺头通过增高血清PINP浓度和降低CTX-1浓度，提高成骨细胞活性和成骨能力，促进骨折局部膜内成骨和软骨内成骨速度，促进骨痂早期改建和塑形，加快骨折愈合，其作用存在量-效依赖性、给药持续时间-效应关系。

蒙药蓝刺头；骨折愈合；I型前胶原N末端前肽；I型胶原C末端肽；成骨细胞

蒙药蓝刺头为常用接骨蒙药，具有接骨愈伤、清热止痛作用[1]；其味苦，性凉、稀、轻、柔、钝。系菊科植物蓝刺头(Echinops lotifolis Tausch)的干燥头状花序，多年本草[2]。始载于《智慧之剑》中, 属于蒙医自采自用药之一，近代蒙医药学文献《认药白晶鉴》中均以阿扎格-刺日敖恩作为乌日格苏图-呼和(蓝刺头)收载[3]。蒙医在治疗前臂骨折、骨不愈合、骨折较轻而筋伤较宽等情况时，惯用内服蓝刺头水煎剂，均有很好的治疗效果。研究发现[4]，蓝刺头全草含黄酮类成分，花序中含量最高。刘岩等[5]研究了蓝刺头对去卵巢模型鼠骨钙素(BGP)的影响，结果认为，蒙药蓝刺头可能通过类雌激素样作用抑制骨吸收，促进骨形成，调节骨吸收与骨形成。为了深入探讨该药促进骨折愈合的作用及机制，本实验拟制作兔桡骨骨折模型，观察蒙药蓝刺头花序对骨折区域组织形态和血清骨代谢指标的影响，以其为蒙药蓝刺头更广泛的应用于临床提供实验依据。

1 实验材料

1.1 实验动物：健康日本大耳白兔共75只，体重 2.0kg～2.5 kg，12wk龄，其中雌性38只，雄性37只，由天津市中西医结合骨科研究所动物实验室提供。动物模型建立、饲养和取材均在天津市中西医结合骨科研究所动物实验进行。

1.2 药品和试剂：蓝刺头(花序)，河北保定安国药材市场购买；骨碎补，天津中医药大学第一附属医院药房购买；盐酸赛拉嗪注射液(速眠新Ⅱ号)，吉林省敦化市圣达动物药品有限公司，批号070031582；兔I型胶原C末端肽(CTX)ELISA检测试剂盒，上海西唐生物科技有限公司，批号1410151；兔I型前胶原N末端前肽(PINP)ELISA检测试剂盒，上海西唐生物科技有限公司，批号1410153；苏木素、伊红，天津市永大化学试剂开发中心。

1.3 仪器：南韩牙科台式钻N3/E102N3，佛山市多易美医疗器材有限公司；高速万能粉碎机YJ-1000A，济南亿健医疗设备有限公司；切片机RM2255 ，德国 LEICA 公司；自动双重纯水蒸馏器SZ-93，上海徐新生化仪器厂；制冰机AF200-PSC50R，日本 SANYO 公司；多功能显微镜CX41，日本 Olympus 公司； X 线机(CR)，意大利IAE 公司。

2 实验方法

2.1 蒙药蓝刺头制备：蒙药蓝刺头原材料由内蒙古国际蒙医医院国家蒙药制剂中提供，原材料为蓝刺头花序，共10kg。将其原材料在内蒙古医科大学蒙医药学院蒙药炮制中心用小型万能粉碎机打磨成粉末状(过80目筛为标准)，并封装成袋，作为实验药品备用。

2.2 骨折模型建立：模型建立参照文献[6]，将动物分笼适应性饲养2wk，手术当日将每只兔称重后可用速眠新Ⅱ号(盐酸塞拉嗪注射液)肌肉注射麻醉(肌注部位：臀肌处，肌注剂量：0.15mL·kg-1体重)，待麻醉后双上肢常规脱毛，实施无菌手术，于双侧桡骨中1/3处纵行切开皮肤及皮下组织，暴露双侧桡骨中1/3部位，用口腔专用磨钻造成3mm完全横断骨折，不作任何固定，生理盐水冲洗切口，逐层缝合切口。术后分笼饲养，常规饲料及饮水。术后连续3d肌肉注射硫酸庆大霉素预防感染， 4万U/次， 1次/d，每日观察动物活动及创口愈合情况。

2.3 动物分组和给药：将75 只日本大耳白兔，随机数字表法分为5组：模型组，蒙药高、中、低剂量组和阳性对照骨碎补组，每组 15只。每组再随机分成3个小组，分别为2 wk组、4 wk组、8 wk组，每组 5只，编号，分笼饲养。各组兔术后均常规饲养，给药剂量按《人兔体表面积折算的等效剂量比值表》计算，术后d1开始给予饲料混合喂养不同剂量的蒙药蓝刺头粉剂(高、中、低剂量组，依次为3g·kg-1、1.5g·kg-1、0.3g·kg-1，其低剂量组为临床等效剂量，高、中、低剂量比例为10:5:1), 1次/d，骨碎补组以临床等效剂量0.3g·kg-1灌胃, 1次/d，模型组灌胃等量蒸馏水日1次。

2.4 标本留取：分别于术后 2、4、8 wk时采用耳缘空气栓塞法处死动物，在无菌条件下取出双侧尺桡骨，观察骨折区域愈合情况拍摄 X 线片，沿骨折断端为中心，缺损区边缘7.5 mm处截骨(长约15～16mm)，投入中性甲醛溶液固定，HE染色。处死前分别留取股动脉血，进行高速低温离心后吸取上清放入1.5mL离心管内，编号，-70℃保存，待血全部留取完毕后进行检测。

2.5 观察指标

2.5.1 血清骨代谢指标测定：取出-70℃血清样本，待血清样本完全溶解后放入低温离心机以3000r/nin离心10min，抽取上层血清样本，严格按照ELISA试剂盒说明书进行操作，测定血清中PINP、CTX-1水平。

2.5.2 X线检查：完整取下双侧尺桡骨，在放射科统一条件下(45kV、80mA、0.08s)拍摄 CR片，观察各个时间段(2wk、4wk、8wk)桡骨骨折断端愈合情况。根据骨痂形成情况及骨折线变化情况，参照Beck LS and Deguzman L评分系统[7]进行骨折愈合状况半定量评定，如有异议，通过影像学专家会诊最终达成一致意见为准。

2.5.3 组织形态学观察:标本进行固定、切片、HE染色后，在光镜(×40、×100)下观察不同时间段(2wk、4wk、8wk)桡骨缺损修复的组织学改变。参照文献[8]骨折愈合组织学评价标准，加以修改，并增加骨髓腔情况进行骨折愈合组织学评分，分为0～4分。

2.6 统计学方法：采用SPSS 13.0统计软件对实验数据进行统计分析，各组的血清PINP、CTX-1检测，X线评分及组织学评分结果采用均数±标准差(±s)表示，各组间比较采用F检验。检验水准为a=0.05，以P<0.05为差异有统计学意义。

3 实验结果

3.1 血清PINP、CTX-1水平测定：本次试验中无兔死亡，均进行采样和数据统计。术后第2wk至8wk时蒙药蓝刺头高、中、低剂量组和骨碎补组PINP均有上升趋势，而CTX-1均有下降趋势，唯有模型组的PINP第4wk后浓度逐渐下降趋势。不同时间点的PIPN 、CTX-1在各自组间均存在显著差异，均具有统计学意义(P<0.001)。相同时间点内除PINP、CTX-1各组中骨碎补组和中剂量组无差异外，其余各组均有显著差异，具有统计学意义(P<0.001)。 PIPN、CTX-1在不同时间变化趋势不同，其中：高剂量组，中剂量组和骨碎补组较为稳定，而蒙药低剂量组，模型组PIPN、CTX-1随时间变化幅度较大，观察所有蒙药剂量(低、中、高剂量)与PINP、CTX-1的浓度变化发现，PINP浓度与用药剂量呈正比关系，CTX-1浓度与用药剂量呈反比关系，结果见表1。

表1 血清PINP、CTX-I水平比较

注：与模型组比较，*P<0.001 ，与第2wk比较，#P<0.001，与第2、4wk比较，△P<0.001.

3.2 X线检查：骨折后2 wk时模型组和蒙药低剂量组骨痂显影不明显，骨折线较清晰，而蒙药高、中剂量组和骨碎补组可见少量骨痂显影，主要位于折线远近端骨外膜下，骨折线略变模糊；第 4 wk时模型组和蒙药低剂量组见骨痂少量显影，骨折断端开始变模糊，而蒙药高、中剂量组和骨碎补组大部分标本均已完全形成骨性骨痂，有连续性骨痂通过骨折线，骨折线明显模糊，且蒙药高剂量组和骨碎补组显著；第8 wk时各组均达临床愈合标准，骨折线消失或显著模糊。而蒙药高剂量组骨折愈合塑形良好，髓腔已贯通，蒙药中剂量组和骨碎补组欠佳。通过参照X线片Beck LS and Deguzman L评分系统进行骨折愈合状况半定量评定，各组间比较显示：2wk时蒙药高剂量组与模型组和蒙药低剂量组比较有显著性差异(P<0.01)；蒙药低剂量组与模型组差别有统计学意义(P<0.05)；骨碎补组与模型组、蒙药低剂量组差别有统计学意义(P<0.05)。4wk时蒙药高剂量组与模型组和蒙药中、低剂量组差别有统计学意义(P<0.05)；骨碎补组与模型组和蒙药中、低剂量组比较具有统计学意义(P<0.05)。8wk时蒙药高剂量组与模型组和蒙药低剂量组比较具有统计学意义(P<0.05)；骨碎补组与模型组比较具有统计学意义(P<0.05)，结果见表2、图1。

表2 各组各期X线片Beck LS and Deguzman L评分系统半定量比较

注：与模型组比较，*P<0.05，△P<0.01；与低剂量组比较，#P<0.05，☆P<0.01；与中剂量比较，P<0.05.

3.3 组织学观察：蒙药蓝刺头高、中剂量组和骨碎补组骨折愈合情况明显好于模型组和蒙药蓝刺头低剂量组，而蒙药高剂量组骨折愈合情况最为显著。参照文献进行骨折愈合组织学评价，各组间比较显示，各期蒙药蓝刺头高剂量组与模型组和蒙药蓝刺头低剂量组比较均有显著性差异(P<0.01)；蒙药蓝刺头中剂量组和骨碎补组在第2、4、8wk时与模型组比较也具有显著性差异(P<0.01)，结果见表3 、图2。

表3 各组各期骨折愈合组织学评分

注：与模型组比较*P<0.01，与低剂量组比较#P<0.01；△P<0.05；与中剂量比较，☆P<0.05；与骨碎补组比较，P<0.05.

4 讨论

骨折愈合是极其复杂修复的过程，是骨组织再生和重建的过程，从组织形态学和细胞学的变化，将骨折愈合过程大体可分为3个阶段[9]，即血肿机化期(早期)、骨痂形成期(中期)、骨板形成-塑型期(后期)。但三者之间不可截然分开的，而是相互交织逐渐演进的过程。

本实验中观察到，在骨折愈合早期(2wk时)蒙药蓝刺头高、中剂量组和骨碎补组骨折断端已被纤维组织包裹，骨折线两端的内、外骨膜下均可见明显的骨小梁形成，并呈逐渐向骨折断端中心延伸的趋势，外围可见大量软骨细胞形成，呈软骨岛状改变。骨折愈合中期(4 wk时)各组软骨内成骨和膜内成骨较活跃，骨小梁大量形成，并穿插排列进一步增多增粗，连接于骨折断端，其间可见大量的纤维骨痂、软骨细胞、炎性细胞及毛细血管明显减少；模型组、蒙药低剂量组大部分标本骨折断端间仍为纤维性组织连接，骨折wk围骨小梁纤细、稀疏，骨痂体积较小，而蒙药蓝刺头高、中剂量组和骨碎补组大部分标本骨折断端为骨小梁相连接，骨折wk围骨小梁密度相对较高，骨痂体积较大。骨折愈合后期(8wk时)，蒙药蓝刺头高、中剂量组和骨碎补组骨折断端间骨小梁转变为板层骨，外围骨小梁出现较多吸收腔隙，髓腔再通，而蒙药蓝刺头高剂量组大部分标本髓腔再通，模型组、蒙药低剂量组骨折断端间仍可见大量骨小梁有序排列，逐渐向板层状骨过渡，标本髓腔未全再通。提示蒙药蓝刺头能够促进骨折局部膜内成骨和软骨内成骨速度，促进骨痂早期改建和塑形，具有促进骨折愈合作用。

Ⅰ型前胶原氨基端前肽(PINP)和Ⅰ型前胶原羧基端前肽(PICP)是成骨细胞合成并释放出前胶原纤维的细胞外分解产物，二者在血清中的含量反映了成骨细胞合成骨胶原的能力，可以被认为是监测成骨细胞活性和成骨能力的特异性生化指标。PINP的解离和Ⅰ型胶原的合成比例为 1:1，故 PINP 可反映成骨细胞的活性和骨形成速率，升高提示Ⅰ型胶原的合成速率加快，骨转换活跃[10]。血液中的 PINP、PICP 等由肾脏和肝脏分解去除，Ⅰ型胶原不溶于水，可通过检测Ⅰ型胶原代谢产物来检测Ⅰ型胶原的代谢状况。目前PINP的检测广泛的应用到药物干预治疗骨折及骨代谢疾病的疗效的评估和恶性肿瘤骨转移疾病的检测中，尤其在药物干预治疗过程中动态观察与监测具有较高的临床价值。Ⅰ型胶原 C 端肽(CTX-1)也是Ⅰ型胶原诸多降价产物中的一种，于 1994 年Bonde等[11]建立 CTX-1 的检测法，在骨基质的不断重建中，Ⅰ型胶原被不断的分解为 CTX-1，并被释放入血，通过测定血中 CTX 的含量就能够反映出骨基质的吸收状态，既能够对某些代谢性骨病进行早期诊断，又能够对抗骨吸收药物进行药效评价。CTX-1作为骨吸收的特异性指标，已经广泛的应用到小儿佝偻病、骨质疏松症、恶性肿瘤骨转移、骨折愈合的检测中。本次实验通过测定促进骨形成和骨吸收指标PINP、CTX-1结果表明，蒙药蓝刺头能够增高血清PINP含量、降低CTX-1含量，其作用存在量-效依赖性、给药持续时间-效应关系，提示其可能提高成骨细胞活性和成骨能力，并促进骨生长的同时也抑制骨吸收发挥重要作用。

综上所述，蒙药蓝刺头可能通过提高血清PINP浓度和降低CTX-1浓度，提高成骨细胞活性和成骨能力，促进骨折局部膜内成骨和软骨内成骨速度，促进骨痂早期改建和塑形而加快骨折愈合。但蒙药蓝刺头促进骨折愈合相关物质基础还需要进一步深入研究。

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内蒙古自然科学基金( 2015MS08131)

R291.2

B

1006-6810(2017)05-0064-04

2017年1月9日收稿