樊英，盖春蕾，王晓璐，许拉，刁菁，于晓清，叶海斌



中草药抑制剂对中国对虾致病菌哈维氏弧菌的抑制效果

樊英，盖春蕾，王晓璐，许拉，刁菁，于晓清，叶海斌*

(山东省海洋生物研究院，山东 青岛 266104)

用抑菌圈法和微量二倍稀释法研究金银花、车前草等16种中草药提取液和纳米锌、纳米银对中国对虾来源病原菌——哈维氏弧菌TCBS–G的抑制效果。结果表明：纳米锌对TCBS–G产生的透明抑菌圈直径达35 mm，地锦的透明抑菌圈直径约25 mm；采用96孔板倍数稀释法测定最小抑菌浓度()，纳米锌、地锦的最小抑菌浓度均为12.5 mg/mL，纳米银的达6.25 mg/mL；采用MTT比色法检测不同抑制剂对哈氏弧菌生物膜形成的影响，纳米锌、纳米银对TCBS–G生物膜形成具有明显的抑制作用，药液质量浓度大于3.125 mg/mL时具有显著差异(<0.05)；黄芪、地锦药液质量浓度大于12.5 mg/mL 时抑制作用显著(<0.05)。普通药敏试验结果显示，该菌株对头孢他啶、庆大霉素、复方新诺明等药物极其敏感，抑菌圈直径达20 mm以上，对头孢氨苄、四环素等均不敏感。

中国对虾；哈维氏弧菌；中草药；纳米锌；纳米银；敏感性

目前，中国对虾养殖品种主要有凡纳滨对虾、中国对虾、斑节对虾和日本对虾。各品种养殖面积迅速增长，养殖规模不断扩大[1]。由于生产经验不足和可持续发展理念缺乏及养殖者对经济利益过分追求，养殖水质及生态环境恶化，细菌病和病毒病等各种疾病蔓延，使虾养殖产业经济损失严重[2–3]。细菌、真菌、病毒、寄生虫等各种病害在对虾养殖过程中都有不同程度发生，细菌性疾病——弧菌病是其中危害对虾育苗及养殖的重要病害之一。哈维氏弧菌()是一种条件致病菌。该菌通常在病灶处大量繁殖，使内脏等发生严重病变，从而导致养殖动物死亡[4–5]。

中草药因其独特的性质，在水产养殖业越来越受到亲睐。中草药防治疾病的机理可能在于它的复杂成分。中草药中的多糖类、生物碱类等有效活性成分既具有广泛的抗病力，又可作为营养物质调节动物机体的抗病因子，提高动物自身组织的防御能力和免疫功能[6–8]。笔者研究不同抑制剂对中国对虾来源病原菌哈维氏弧菌的抑制效果，以期研发具有针对性的专用抗菌药物或饲料添加剂，为对虾养殖病害防控和实现绿色健康养殖提供参考。

1　材料与方法

1.1　供试菌株和中草药及其他试剂

供试哈维氏弧菌从某海水养殖场濒死中国对虾病变组织(鳃、肝胰腺)中分离得到，保存于–80 ℃。纳米锌、纳米银均来自南京精德丰新材料科技有限公司。大黄()、公丁香()、鸡血藤()、五倍子(–)、金银花()、苏木(–)、地锦()、艾草(–)、黄芩()、穿心莲(–)、黄芪()、桑叶()、石韦()、车前草()、苜蓿()、金钱草(Forst)等均购自宝鸡市方晟生物开发有限公司。药敏试剂盒购自杭州天和微生物试剂有限公司。MTT，又称噻唑蓝 ，化学名为3–(4，5–二甲基噻唑–2)–2，5–二苯基四氮唑溴盐购自Sigma。其他试剂均为化学分析纯。

1.2　菌液及中草药提取液的制备

将供试菌株纯培养物转接于2216E培养基上，28 ℃过夜培养，稀释活化菌液至1.0×108cfu/mL，4 ℃保存，备用。

取16种中草药提取物各1 g，分别用10 mL无菌水浸泡30 min，浸泡期间不断搅拌，用双层纱布过滤，微沸煎煮5 min灭菌，4 ℃保存，备用。

1.3　中草药体外抑菌效果及最小抑菌浓度的测定

采用琼脂扩散抑菌圈法判断不同抑制剂对TCBS–G的体外抑制效果。将150 μL活化的TCBS–G均匀涂布于2216E平板，随即放入无菌牛津杯4个(十字直径摆放，保证每孔之间的距离不小于2 cm)，每孔加入50 μL灭菌药液，以只涂有菌液的平板作为对照。28 ℃培养24 h，用游标卡尺测量抑菌圈；每孔取不同方向测量3次，取平均值。抑菌圈直径≥20 mm 为强，以“+++”表示；抑菌圈直径＞10～20 mm为中等，以“++”表示；抑菌圈直径为＞3～10 mm 为弱，以“+”表示；抑菌圈直径≤3mm 无抑菌作用，以“－”表示。

选取抑菌效果明显的不同抑制剂 (纳米锌、纳米银、黄芪、地锦、鸡血藤、天蚕素、车前草)，参照吴增华[9]的方法，用优化的二倍稀释法进行测定。取无菌96孔酶标板，每孔加入 100 μL灭菌2216E液体培养基；第一孔中加入100 μL无菌中草药液，充分混匀后取出 100 μL混合液加入到第2孔中，充分混匀后再取100 μL混合液加入到第3孔，以此类推，获得原药液质量浓度的 1/2、1/4、1/8，……，1/128；第8孔作为阴性对照组，加入 100 μL中草药液后不加菌悬液，其余7孔均加入 100 μL菌悬液 (1×108cfu/mL)；将最后一行设为阳性对照组，不加中草药液，加入 100 μL培养基，再加入 100 μL菌悬液，混匀后置于 28 ℃培养 24 h。参照美国临床实验室标准化协会(CLSI)发布的水产细菌药敏检测标准(M49–A) ，将细菌存活率≤20%的最低药物质量浓度判定为最小抑菌浓度()。

1.4　哈维氏弧菌TCBS–G生物膜的形成及抑制剂对其形成的影响

参考黎家勤的方法[10]，将TCBS–G通过2216E液体培养基按1∶10和1∶100 的比例进行稀释，分别将稀释好的菌悬液以每孔200 μL加入到无菌96 孔酶标板(设3个平行)，以无菌液体培养基为对照，28 ℃恒温静置培育24、36、48 h；弃孔内培养液，用无菌生理盐水清洗，60 ℃干燥固定，每孔加入100 μL 0.1%结晶紫，室温染色10 min，用无菌生理盐水清洗多余染液3次；待干燥后，每孔加入200 μL 33%的乙酸充分溶解结晶紫，用酶标仪测定590 nm。

研究纳米锌、纳米银、黄芪、地锦、鸡血藤、天蚕素和车前草对生物膜形成的影响。TCBS–G活化菌液用2216E液体培养基按1∶100进行稀释、分装；分别加入同体积7种不同的抑制剂，混匀，分别吸取200 μL加入到无菌96 孔酶标板中，设3个平行，并设阳性对照(含0.1 mol/L EDTA)、阴性对照(仅含培养基和供试菌液) 、空白对照(仅含培养基)和无菌的药物对照(仅含中草药液和培养基)，倍比稀释(1/2，1/4，1/128)后28 ℃恒温静置培养48 h。待生物膜形成后，采用MTT 法检测抑制生物膜量：将50 μL MTT 溶液(通过预温的0.15 mol/L PBS按1∶5的比例进行稀释) 加入每孔中，28 ℃培养箱温育5 h；弃每孔溶液，用PBS冲洗3次；每孔加入二甲基亚砜DMSO 150 μL，振荡5 min，检测540 nm。

1.5　不同药物对致病菌的抑制效果

用药敏纸片法检测抑制效果。以无菌涂布棒将1.0×108cfu/mL菌液均匀涂布于2216E平板，将不同的药敏纸片按照规则贴于涂布平板上，培养24 h后观察，记录各药敏纸片的抑菌圈直径。

1.6　数据处理

采用SPSS 17.0进行数据统计与分析。

2　结果与分析

2.1　不同抑制剂对哈维氏弧菌TCBS–G的体外抑制效果

由表1可见，纳米锌对TCBS–G的抑制作用最强，抑菌圈直径达35 mm，其次是纳米银。这可能是纳米级的锌和银更容易参与到细菌的代谢过程中，从而其抑菌效果比单纯金属锌和单独金属银的更好。黄芪和地锦对TCBS–G表现出了极强的抑制效果，抑菌圈直接均达25 mm，金银花、五倍子、鸡血藤的次之；石韦对TCBS–G表现出促生长现象。可见，中草药以其复杂的成分对TCBS–G产生了不同的作用。

表1　不同抑制剂对哈维氏弧菌TCBS–G的体外抑制效果

“+++”示极敏感；“++”示中度敏感；“+”示敏感；“–”示不敏感。

2.2　最小抑菌浓度(MIC)检测结果

通过二倍稀释法测定优势抑制剂纳米锌、纳米银、黄芪、地锦、鸡血藤、天蚕素、车前草对TCBS–G的最小抑菌浓度分别为12.5、6.25、12.5、12.5、25、25、25 mg/mL。

2.3　不同稀释比例和不同培育时间下哈维氏弧菌TCBS–G生物膜的形成情况

哈维氏弧菌TCBS–G起始浓度不同、培育时间不同，生物膜的形成量不同。在590 nm下通过分光光度计比色法获得其值，在稀释比1∶10的情况下，36 h的生物膜形成量最高，590 nm为0.527 9；在稀释比1∶100时，48 h的生物膜形成量最高，590 nm为0.586 8。对于生物膜的形成，并不是浓度越高生物膜的形成量就越高，生物膜的形成量与起始浓度和培育时间相关。本研究中选取稀释比1∶100和培育时间48 h进行后续试验。生物膜的形成也与哈维氏弧菌的致病机理有关，这方面还有待研究。

2.4　不同抑制剂对哈氏弧菌TCBS–G生物膜形成的影响

由表2可见，不同浓度抑制剂对TCBS–G生物膜形成产生不同的抑制效果。浓度越高，抑制效果越强。当质量浓度大于3.125 mg/mL时，纳米锌、纳米银对TCBS–G生物膜的形成产生了明显的抑制(<0.05)；当地锦、黄芪等的浓度大于12.5 mg/mL时，可对TCBS–G生物膜的形成产生抑制(<0.05)，不同的抑制剂的抑制效果不同。

表2　不同抑制剂浓度下的OD540 nm

2.5　30种不同药物对致病菌的抑制效果

由表3可见，复方新诺明、氯霉素、头孢他啶对TCBS–G产生了及其敏感的抑制效果，透明抑菌圈直径达20 mm以上；诺氟沙星、哌拉西林等的抑制作用相对较弱。

表3　 30种药物对菌株TCBS–G的抑制效果

“+++”示极敏感；“++”示中度敏感；“+”示敏感；“–”示不敏感。

3　结论与讨论

目前，在水产养殖中预防或治疗弧菌病主要使用抗生素类药物，但治疗效果并不理想，且抗生素的使用不仅使细菌产生耐药性，还会严重破坏水体质量和生态环境，进而对人体健康造成危害[11]。通过中草药等绿色安全药物或饲料添加剂进行病害防控是水产养殖业发展的趋势和需要，是药物与营养价值的结合。中草药具有杀菌、抗病毒、抗应激、促生长、提高免疫等多重作用，且实际养殖过程中残留少，不产生耐药性[12–16]。本研究中发现，不同中草药对中国对虾哈维氏弧菌TCBS–G产生的体外抑制作用不同，黄芪、地锦产生了较强的抑菌作用，能明显抑制TCBS–G的生长。这可能是因为不同中草药的主要活性成分不同，不同活性成分与病原菌产生了不同的拮抗作用(其具体抑制机理有待研究)。饲料中添加锌对凡纳滨对虾养殖具有很强的促进作用[17]。天蚕素抗菌肽具有杀菌效率高、稳定性好、免疫原性低、不易产生耐药性、产率高等优点，是无毒、无害、无残留的绿色产品，是新一代抗生素的替代品[18]，本研究中纳米锌和天蚕素对TCBS–G均产生了明显的抑制作用，实际应用中纳米锌和天蚕素的使用时间、使用剂量及应用方式等还有待研究。

哈维氏弧菌是水产养殖业的主要致病菌之一，它在水体中主要以生物膜的形式生存。生物膜是细菌聚集、粘结在一起分泌的黏性物质，在环境中形成的一层黏膜状物质，能保护细菌对抗外界侵犯，增强其对抗菌药物的抵御能力[19–20]。本实验室分离获得的哈维氏弧菌TCBS–G在生长过程中即形成生物膜，不同抑制剂以其不同成分对TCBS–G生物膜形成发挥影响。纳米锌作为一种新生材料，比金属锌制剂发挥的作用更大。质量浓度100 mg/mL的纳米锌对TCBS–G生物膜的形成产生了极显著的抑制作用(<0.05)；随着质量浓度的降低，纳米锌对TCBS–G生物膜形成的抑制作其减小，当质量浓度小于3.125 mg/mL时，纳米锌对TCBS–G生物膜的抑制作用与阴性对照组的差异无统计学意义。黄芪、地锦、鸡血藤等中草药液也抑制了TCBS–G生物膜的形成。

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责任编辑：王赛群

英文编辑：王库

Effects of different inhibitors onfrom

FAN Ying, GAI Chunlei, WANG Xiaolu, XU La, DIAO Jing, YU Xiaoqing, YE Haibin

(Marine Biology Institute of Shandong Province, Qingdao 266104, China)

The inhibitory effects of,and other 16 herbal extracts and nano–zinc, nano–silver on(TCBS–G) fromwere studied by means of disc agar diffusion and micro double dilution methods. The results showed that nano–zinc had a strong inhibitory effect on TCBS–G with the diameter of 35 mm inhibition zone, followed bywith the diameter of 25 mm. Theof nano–zinc anddetected on 96 well plates via multiple dilution method was 12.5 mg/mL, the value was 6.25 mg/mL for that of nano–silver. From the test of different inhibitors on biofilm formation ofby mean of MTT assay, we found that the inhibitory effect of nano–zinc on the formation ofbiofilm was significant, especially when the solution concentration was above 3.125 mg/mL (<0.05), and there were also significant effects forand,when their concentration were above 12.5 mg/mL (<0.05). The result from susceptibility test of general drugs showed that the TCBS–G was very sensitive to Ceftazidime, Gentamicin, compound Sulfamethoxazole with less than 20 mm diameter of inhibition zone, however, it was not sensitive toCephalosporinsTetracycline etc.

;; herbal; nano–zinc; nano–silver; sensitivity

S945.1+9

A

1007-1032(2017)06-0657-05

2017–06–12

2017–11–07

国家现代农业产业技术体系建设专项基金(CARS–47)；山东省现代农业产业技术体系虾蟹类产业创新团队项目(SDAIT–13)

樊英(1980—)，女，硕士，副研究员，主要从事水产动物养殖及病害防控研究，fy_fy123@126.com；

通信作者，叶海斌，副研究员，主要从事水产动物养殖及病害防控研究

投稿网址：http://xb.hunau.edu.cn