陈二龙，苏家恩，范志勇，王德勋，户艳霞，王新中，孙军伟，宋朝鹏*



烘烤过程中霉变烟叶主脉超微结构的变化

陈二龙1，苏家恩2，范志勇2，王德勋2，户艳霞2，王新中2，孙军伟2，宋朝鹏1*

(1.河南农业大学烟草学院，河南 郑州 450002；2.云南省烟草公司大理州公司，云南 大理 671000)

以云烟85的适熟中部叶(第9~11位叶)为材料，每隔4 h观察气流上升式四层密集烤房的顶层(第4层)烟叶在烘烤过程中的霉变状况，至相邻2次霉变烟叶数无增加(60 h)，停止观察；每隔12 h用扫描电镜随机观察霉变烟叶主脉端口和表皮的超微结构，至60 h时终止。结果表明，在烘烤过程中的22.3 h左右，顶层烟叶开始发生霉变，于43.47 h左右暴发，其霉变率为29.2%，至56.7 h左右终止，霉变率达58.2%，经拟合，烟叶霉变率曲线符合“S”型曲线； 0~12 h烟叶主脉端口破损，且有部分晶体产生，12~24 h晶体裂解，且出现菌丝，48~60 h时，霉菌迅速生长繁殖，表皮霉菌生长量最大；0~12 h，烟叶主脉表皮细胞的宽度缓慢收缩，且有微量的霉菌孢子萌发，在12 h之后快速收缩，12~24 h出现菌丝，霉菌快速生长繁殖期处于48~60 h，60 h表皮腺毛干瘪。烟叶霉变的发生时间处变黄中期和末期，防控烘烤过程中烟叶霉变的最佳时间应在22.3 h之前。

烘烤；霉变；烟叶主脉；超微结构

烤烟霉变分为两类：一类是烘烤过程中烟叶霉变[1]；另一类是烤后储存期间烟叶霉变[2]。烤中霉变主要发生在烟叶主脉端口处，即叶柄发霉[3]，研究烘烤过程中烟叶霉变规律及其主脉的超微结构变化，对防控烘烤过程中烟叶霉变有着重要作用。

曾婷英等[1]研究表明，在烘烤过程中，烟叶霉变的发生具有明显的阶段划分，变黄前期烟叶开始出现霉变，变黄中期烟叶霉变速度较快，变黄后期霉变速度减缓。王涛[4]提出，烟叶霉变率与烟叶在烤房内空间分布有关，低温层烟叶的霉变率大于高温层(气流上升式烤房的低温层为顶层)。王永栋[5]研究表明，挂杆烟叶的霉变位置主要为叶柄处，而叶片较少霉变。景炳年等[6]通过观察烟叶超微结构(细胞结构破损程度)研究抑制剂VFB对花叶病的影响，指出该抑制剂对花叶病的抑制具有较好的作用。刘华山等[7]采用电镜观察部分植物中的提取液对烟草花叶病的病毒颗粒的破坏程度，证实提取液可减缓花叶病的危害。商文静等[8]通过电镜检测感染花叶病的烟叶组织的超微结构，发现烟叶筛管中含有大量晶体，且细胞间隙中均有未知的致密性物质。

笔者以云烟85为试验材料，自烘烤始，观察烤中烟叶霉变状态，采用FEI Quanta 200扫描电镜观察霉变烟叶主脉端口和表皮的超微结构，研究霉菌在烟叶主脉上的生长状态，以及烟叶霉变前期、中期和后期主脉组织结构的变化，以期为防控烘烤过程中烟叶霉变提供理论依据。

1　材料与方法

1.1　材料

烤烟品种为云烟85。

1.2　方法

试验于2016年7—9月在云南省大理州大理县凤仪镇江西村进行。

采收叶面积差异小、叶色较为均一的适熟中部叶(第9~11位)，并进行挂牌标记。将试验烟叶装于气流上升式四层密集烤房的顶层(第4层)，三段式烘烤工艺进行烘烤。采用摄像头观察烟叶霉变状态，在开烤时对烟叶主脉进行第1次取像，以后每隔4 h对烘烤过程中烟叶进行图像采集，当相邻2次感染霉菌的烟叶数无增加，终止取像。将采集的图像信息于电脑中读取，以视野范围内烟叶数为总烟叶数，以主脉端口处具有白色或灰白色毛绒状的烟叶数为霉变烟叶数。烟叶霉变率=(霉变烟叶数/总烟叶数)×100%[9]。

自烘烤开始，取烘烤过程中12、24、36、48和60 h的霉变烟叶，进一步取烟叶主脉端口1 mm厚的截面和端口处5 mm×2 mm×1 mm的表皮作为样品，参照文献[10–12]方法，对样品进一步处理，用于FEI Quanta 200扫描电镜观察。

运用Excel 2010汇总数据；采用Sigmaplot 12.5分析数据并绘图；利用Matlab 2014b获取非线性回归方程。

2　结果与分析

2.1　烘烤过程中烟叶霉变发生进程

在烘烤过程中，第4层烟叶于烤中22.3 h左右开始发生霉变，之后霉变烟叶逐渐增加，在烤中40~ 44 h的霉变增长最快，即该时间段存在霉变暴发点，到烤后56.7 h左右终止，虽然烘烤仍在进行，但烟叶霉变率保持不变，则此时霉变率与60 h的值接近，即霉变率达到58.2%。烟叶在烘烤过程中的霉变率曲线与“S”型曲线(延滞期、指数期和稳定期)[13]相似，利用Logistic方程回归，=0.583 2/ (1+exp(–0.238 2(–43.47)))，2为0.997 7。在烘烤过程中，烟叶发生霉变的暴发时间(拐点)为43.47 h，其霉变率为29.2%。

观察时间/h

2.2　烘烤过程中霉变烟叶主脉超微结构的变化

2.2.1主脉端口超微结构的变化

图2–1显示，鲜烟叶主脉端口细胞轮廓清晰，结构较为完整；烤中12 h，烟叶主脉端口未发生霉变，但细胞轮廓模糊，破损较为严重，具有较多的块状异物，甚至充满整个细胞腔(图2–2)；烤中24 h，部分烟叶主脉端口轻微霉变和腐烂，其细胞结构的破损程度和表面异物进一步增加，表层产生部分白色的霉菌菌丝(图2–3)；烤中48 h，霉变烟叶数增加，霉变程度和腐烂程度加剧，菌丝覆盖于烟叶主脉端口的范围增加，且穿梭于异物之间(图2–4)；烤中60 h，烟叶霉变终止，霉变和腐烂极为严重，菌丝颜色由白色转变为灰色，霉菌菌丝将烟叶主脉端口的细胞结构和异物完全覆盖(图2–5)。霉菌主要生长在烟叶主脉端口的表皮，其次是皮层，再次是中柱(图2–6)，表明霉变烟叶主脉端口细胞的破损与霉菌的生长繁殖有关，烘烤48~60 h，霉菌迅速生长繁殖。

图2　霉变烟叶主脉端口的超微结构

2.2.2主脉表皮超微结构的变化

烤前烟叶主脉表皮相对洁净(除腺毛)，气孔微张，其内部无明显异物，细胞宽为34.43 mm左右(图3–1)；烤中12 h，烟叶主脉表皮未呈现出肉眼可见的霉变，但具有轻微变褐的现象，表皮面含有少量的粉末状物质，且部分气孔被填充，表皮细胞间隙具有微量的霉菌孢子萌发(芽管)，细胞轻微横向收缩，宽为33.38 mm左右(图3–2)；烤中24 h，肉眼可见烟叶主脉表皮发生霉变，霉菌菌丝明显增加，且腺毛周围的菌丝生长旺盛，主脉表皮细胞横向收缩较为明显，细胞宽为25.26 mm左右(图3–3)；烤中48 h，霉菌继续生长繁殖，且菌丝与腺毛相互缠绕，表皮细胞持续横向收缩，细胞宽径约为19.25 mm，胞间隙增加，部分细胞间具有明显的缝隙，但表皮细胞轮廓模糊(图3–4)；烤中60 h，霉变烟叶数无增加，霉菌菌丝完全覆盖于烟叶主脉表皮细胞(除部分腺毛外，图3–5)，烟叶主脉表皮上腺毛干瘪(图3–6)。综上，烘烤过程中，主脉表皮细胞上的霉菌逐渐增加，且表皮细胞上霉菌萌发时间较早，霉菌的旺长期处于48~60 h；表皮细胞的横向收缩在12 h之后加快，在48 h收缩率达44.08%左右。

1　烤前烟叶；2　烤中12 h，红色标记为芽管；3　烤中24 h；4　烤中48 h，蓝色标记为细胞缝隙；5　烤中60 h；6　烤中60 h 腺毛。

3　结论与讨论

有研究表明，烟叶霉变的发生具有一定规律[4]，在烘烤过程中，烟叶霉变发生呈现先缓慢、后急促、再缓慢增加的趋势，以变黄中期的霉变速度最快[1]。本研究结果表明，气流上升式四层密集烤房的顶层烟叶霉变于22.3 h开始，43.47 h(29.2%)暴发，56.7 h(58.2%)终止，烟叶主脉端口的截面和表皮被霉菌快速侵染发生在48~60 h，即霉菌快速生长繁殖处于变黄中后期，因此，防控烟叶霉变的最佳时间应为22.3 h之前，于43.47 h之后采取措施则难以达到防控效果。烟叶在霉变之前，其表层发生褐变，引发烟叶褐变的其中一个条件是组织破损[14]，而组织破损易引发霉变发生[15]，在烘烤过程中烟叶主脉组织结构的损伤，为霉菌的入侵创造了条件，霉菌的生长繁殖加速了烟叶主脉组织结构的破损和内含物的损失。前人研究表明，病原微生物诱发植物组织分泌晶体状物质，使植物组织离子平衡、病虫害防御和解毒等[16–18]。本研究结果表明，在微生物入侵之前，烟叶主脉端口截面组织分泌大量晶体，可能是烘烤过程中的逆境条件导致了晶体的产生。烟叶主脉表皮细胞在12 h之后的细胞快速收缩，且在48 h已收缩44.08%，这一研究结论与王亚辉等[19]研究结果存在差异，即12 h之后的收缩较快，且收缩程度较大，其原因可能是因为霉菌入侵烟叶主脉，获取细胞的营养物质，加速了细胞的横向收缩。

[1] 曾婷英，顾钢，张绍升．烘烤期烟叶霉烂病的病原鉴定[J]．中国烟草学报，2014，20(4)：65–68.

[2] 孔凡玉，林建胜，张成省，等．储烟霉变机理与防霉技术研究进展[J]．中国烟草学报，2009，15(5)：78–81.

[3] 苏家恩，杨程，米建华，等．红花大金元烟叶烘烤过程中叶柄发霉药剂防效试验[J]．中国烟草学报，2010，16(3)：64–66.

[4] 王涛.烟叶烘烤产生“霉烂病”的原因及防止方法[EB/OL]// http://www.yntsti.com/Technology/Modulatio n/BakingProcess/2015/819/139236.html．(2015–08–19)[2017–05–09].

[5] 王永栋．烘烤期烟草霉烂病的病因与防治[D]．福州：福建农林大学，2016.

[6] 景炳年，李林茹，何军，等．VFB抗烟草花叶病毒活性及对烟草叶片超微结构的影响[J]．西北农林科技大学学报(自然科学版)，2011，39(6)：159–164.

[7] 刘华山，白海群，韩锦峰，等．几种植物提取液对TMV体外活性及烟草叶片超微结构的影响[J]．中国农业科学，2010，43(5)：957–964.

[8] 商文静，吴云锋，赵小明，等．壳寡糖诱导烟草抗烟草花叶病毒的超微结构研究[J]．植物病理学报，2007，37(1)：56–61.

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[12] 方从兵，盛炳成，章镇．扫描电镜不同制样方法对果梅花粉形态的影响[J]．安徽农业大学学报，2000，27(1)：73–77.

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责任编辑：罗慧敏

英文编辑：罗维

Changes of ultrastructure of midrib in mildew tobacco leaves during flue curing

CHEN Erlong1, SU Jiaen2, FAN Zhiyong2, WANG Dexun2, HU Yanxia2, WANG Xinzhong2, SUN Junwei2, SONG Zhaopeng1*

(1.College of Tobacco Science, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China; 2.Dali Branch of Yunnan Province Tobacco Company, Dali, Yunnan 671000, China)

The suitable middle leaves (No. 9–11) of Yunyan85 were used as experimental materials, and the tobacco leaves located on the top layer of the four–layer air rising type curing–barn were observed for mildew every 4 h by camera, when the number of mildew leaves in two successive observations was not amplified (60 h), the observation was stopped. The ultrastructure of the midrib and epidermis of the tobacco leaves were observed every 12 h by scanning electron microscopy, at 60 h, the test was terminated. The results showed that during the curing process, tobacco leaves began to mildew at about 22.3 h, the mildew outbroke at about 43.47 h, the mildew rate was 29.2%, and tobacco leaves stopped mildew around 56.7 h with mildew rate 58.2%. After calculation, the mildew rate curve conforms to the “S” type curve; at 0–12 h, the midrib of the tobacco leaves were damaged and some crystals were produced, in 12–24 h, crystals were cleaved and hyphae appeared, at 48–60 h, rapid growth and reproduction of mildew was happened and the amount of epidermal mildew was the largest; in 0–12 h, the width of the epidermal cells in the midrib of the tobacco leaves contracted slowly with a slight amount of mildew spore germination, rapid contraction occurred after 12 h, hyphae appeared in 12–24 h. mildew rapid growth and reproduction period occurred between 48–60 h, at 60 h, the glandular hairs on the epidermis were shrivelled. The occurrence time of tobacco mildew is in the middle and late yellowing period, the best time to control tobacco mildew is before 22.3 h.

flue curing; mildew; tobacco midrib; ultrastructure

S572.01

A

1007-1032(2017)06-0626-04

2017–06–02

2017–09–19

中国烟草总公司云南省公司项目(2016YN10)

陈二龙(1992—)，男，河南商丘人，硕士研究生，主要从事烟草调制加工研究，celyctz@163.com；

通信作者，宋朝鹏，博士，副教授，主要从事烟草调制与加工研究，ycszp@163.com

投稿网址：http://xb.hunau.edu.cn