刘 瑶，尹伟力，张四化，岳志芹，孙 涛

( 1.荣成出入境检验检疫局，山东 荣成 264300； 2.烟台出入境检验检疫局检验检疫中心，山东 烟台 264000；3.武汉市动物疫病防控中心，湖北 武汉 430003； 4.山东出入境检验检疫局技术中心，山东 青岛 266002 )

鲤春病毒血症病毒焦磷酸测序检测技术的建立

刘 瑶1，尹伟力2，张四化3，岳志芹4，孙 涛4

( 1.荣成出入境检验检疫局，山东 荣成 264300； 2.烟台出入境检验检疫局检验检疫中心，山东 烟台 264000；3.武汉市动物疫病防控中心，湖北 武汉 430003； 4.山东出入境检验检疫局技术中心，山东 青岛 266002 )

通过收集鲤春病毒血症病毒基因序列，设计了鲤春病毒血症病毒最为保守的指纹序列，以及测序引物，建立了鲤春病毒血症病毒焦磷酸测序检测方法。对所构建的鲤春病毒血症病毒焦磷酸检测方法进行特异性试验和灵敏度检测，试验结果表明所建立的方法特异性好，在8种鱼类病毒中能够特异性检测出目的病毒，检测方法灵敏度高，最低检出核酸量为10 pg/μL。对建立的焦磷酸测序检测方法进行了实际应用研究，选取国内采集与进口的鱼类样本共计80批次进行鲤春病毒血症病毒检测。结果显示，焦磷酸测序检测方法可以有效的检出常规RT-PCR不能检出的假阴性样本和弱阳性样本，该方法的灵敏度和特异性可以满足水生动物疫病检测的需要。

鲤春病毒血症病毒；焦磷酸测序；检测

鲤春病毒血症病毒(Spring Viremia of Carp Virus，SVCV)又称鲤鱼弹状病毒，是鱼类强致病性病毒之一[1]。鲤春病毒血症会引起鲤科鱼类急性出血性疾病，该病为必须向世界动物卫生组织申报的疫病。鲤春病毒血症病毒会造成鱼类出现传染性出血性坏死，死亡率高达90%，损失极其惨重[2]。鲤春病毒血症病毒在欧洲广为流行[3-5]。鲤春病毒血症病毒在美洲的太平洋沿岸，从秘鲁到墨西哥的虹鳟(Oncorhynchusmykiss)养殖场流行，偶尔也发现在这些地区的野生虹鳟有鲤春病毒血症病毒感染。美洲的大西洋、加勒比海和墨西哥湾的沿海地区养殖金鱼(Carassiusauratus)也发现了鲤春病毒血症病毒，但在当地野生金鱼种群中尚未发现鲤春病毒血症病毒感染[6]。2002年美国首次报道在国内分离出两株鲤春病毒血症病毒，2006年加拿大首次报道分离出鲤春病毒血症病毒[7]。我国在2004年首次分离出鲤春病毒血症病毒，标志着该病毒已经随着国际贸易增长传入境内[8]。

鲤春病毒血症病毒是影响世界鱼类养殖业的主要病害，如何控制好疫病的爆发，做好病害防治，成为目前我国水产养殖业和进出口行业的重中之重。参照世界动物卫生组织《水生动物疫病诊断手册》[9]及我国的出入境检验检疫行业标准[10]，细胞分离与RT-PCR方法是目前普遍适用且有效的两种检测方法。细胞分离操作复杂，需要盲传2代，检测周期长，而RT-PCR方法必须与测序联合使用才能作为疫病确诊的依据。RT-PCR方法作为一种常规的核酸检测方法，其操作需要经历核酸提取、核酸扩增、琼脂糖电泳、扩增产物回收以及扩增产物测序5个阶段，全程耗时3～5 d，耗时长。如果PCR扩增产物含量低而不能达到测序要求时，测序将无法进行，进而不能对检测到的疑似阳性样品进行最终确诊。

在实际检测工作中，需要建立一种对病原体一段很短但是特别保守的片段进行测序的方法，这种方法要求快速简洁并满足对病原体大量检测的需要。因焦磷酸测序检测方法能够短时间内精准测出短DNA片段的序列，同时可以测96份样品[11-12]，操作简便，能够形成标准化的检测流程，特别适合水生动物疫病病原体的检测与确证。本研究以鲤春病毒血症病毒为研究对象，设计特异的测序引物及其指纹序列，优化焦磷酸测序条件，建立特异、准确的鲤春病毒血症病毒焦磷酸测序检测技术体系，为水生动物病毒病害的监测和防控提供新的检测方法。

1 材料与方法

1.1 毒株核酸

传染性造血器官坏死病毒(IHNV)、流行性造血器官坏死病毒(EHNV)、病毒性出血性败血症病毒(VHSV)、传染性胰脏坏死病毒(IPNV)、牙鲆弹状病毒(HRV)、病毒性神经坏死病毒(VNNV)和锦鲤疱疹病毒(KHV)核酸均由华中农业大学友情提供。鲤春病毒血症病毒毒株由本实验室保存。

1.2 试剂与设备

引物、检测探针均由TaKaRa(宝生物, 大连)公司合成；生物素标记通用引物由Invitrogen(英骏，上海)公司合成；dNTP、ExTaq DNA聚合酶混液、onestep RT-PCR试剂盒、DL2000分子标记均购自TaKaRa(宝生物, 大连)公司；Qiagen DNA提取试剂盒(52906)、Qiagen RNA提取试剂盒(74104)购自于Qiagen公司；Pyro SQA Reagents DNA序列分析试剂盒(96次)、链霉亲和素包被磁珠购自北京基因有限公司。Qiagen PYROMARKID焦磷酸测序仪；PCR扩增仪(Eppendorf)；电泳仪(北京六一，DYY-8C)；凝胶成像仪(天能，G-BOX-EF)；紫外灯观察箱(上海路阳，Icm-26)。

1.3 测序指纹序列的确定及测序引物设计

选取鲤春病毒血症病毒较为保守的G基因作为研究对象。通过美国国立生物信息技术中心(NCBI)查询检索已公开的鲤春病毒血症病毒G基因。去除一些信息不全、不完整的序列片段，对来自同一地点，同一年份，序列差异极小的毒株，选取其中一株，最后选取的序列号如下：

鲤春病毒血症病毒G基因序列登陆号分别为：AJ318079.1、DQ491000.1、U18101.2、JQ666284.1、AY842484.1、AY842485.1、AY842486.1、DQ227500.1、DQ227501.1、DQ227502.1、DQ227503.1、DQ227504.1、AY842488.1、AY842489.1、EU370915.1、AY527273.1。

用DNAStar 7.1软件中附带的Editseq和MegAlign功能，将上面找到的序列输入至软件中，每个碱基进行比对。找到鲤春病毒血症病毒最为保守的20 bp以内的一段序列，作为焦磷酸测序的指纹序列。在指纹序列上、下游设计测序引物。

1.4 测序引物RT-PCR反应

按照Qiagen RNA提取试剂盒说明书提取组织样品或病毒液的RNA。

取2 μL鲤春病毒血症病毒核酸，按照RT-PCR试剂盒说明配置反应体系，加入上游测序引物0.5 μL，标记生物素下游测序引物0.5 μL，DEPC水补足体积至50 μL。PCR仪设定如下程序：50 ℃ 30 min，94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，摸索测序引物的退火温度，72 ℃延伸30 s，共30个循环，最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保温。

取10 μL RT-PCR产物和1 μL加6×Loading buffer混合，在1%琼脂糖凝胶上以5 V/cm电压电泳，以标准分子量作参考，观察是否扩增成功。

1.5 焦磷酸测序反应

取50 μL PCR扩增产物，加入200 μg包被了链酶亲和素的磁珠，室温孵育20 min，让磁珠与PCR产物连接。用测序仪自带的真空泵工具将连接磁珠的PCR产物吸起，然后用70%酒精清洗5 s；放入denatureation buffer清洗5 s；用washing buffer清洗10 s；用真空泵工具将PCR磁珠产物放入反应板中，加入测序引物2 μL，轻轻振摇，释放磁珠。将待测物放入80 ℃烘箱2 min，放置室温冷却。

将待测物放入焦磷酸测序仪中反应，反应温度设置为28 ℃。每次进样的压力选择60 kPa，进样时间设置为8 ms，每轮测序时间设置为65 s。测序引物沿着待测模板，随着不同dNTP的加入而扩增。每当有单个dNTP结合，反应会释放信号，测序仪收集信号，生成测序峰。

1.6 特异性测定

将鲤春病毒血症病毒的测序引物分别与病毒性出血性败血症病毒、流行性造血器官坏死病毒、传染性胰脏坏死病毒、牙鲆弹状病毒、病毒性神经坏死病毒、传染性造血器官坏死病毒和锦鲤疱疹病毒的RNA模板进行RT-PCR扩增，将RT-PCR产物进行焦磷酸测序分析。

1.7 灵敏度检测

将鲤春病毒血症病毒核酸进行10倍倍比稀释后，采用建立的焦磷酸测序方法进行检测，并检测其灵敏度。

1.8 实际样本的检测

2013—2015年，采集我国国内养殖的鱼类样品共计50批次，进口鱼样共计30批次，每批次采集鱼样本至少30尾，鱼品种为鲤鱼(Cyprinuscarpio)、草鱼(Ctenopharyngodonidellus)、黄颡鱼(Pelteobagrusfulvidraco)、大菱鲆(Scophthalmusmaximus)、虹鳟，采样样品为鱼苗、幼鱼或成鱼。取鱼样本的肾、脾、肝、眼、脑等器官。对于鱼苗，取整尾鱼作为样品，将组织匀浆，提取RNA，进行病毒性出血性败血症病毒焦磷酸测序检测。

取样本核酸，进行鲤春病毒血症病毒的常规RT-PCR检测，检测引物参考世界动物卫生组织《水生动物疫病诊断手册》[9]，将这两种检测结果进行比较。

2 结 果

2.1 测序指纹序列的确定及测序引物设计

鲤春病毒血症病毒G基因序列比对后，发现包含712～722位点的核酸序列“TGGGGGCGAATGCAGA”高度保守，将其作为标准指纹序列(图1，图2)。

根据鲤春病毒血症病毒的指纹序列，设计测序引物(表1)。

表 1 测序引物设计

图1 鲤春病毒血症病毒的指纹序列

图2 鲤春病毒血症病毒G基因引物设计结果

2.2 测序引物的RT-PCR扩增

通过对PCR的变性、退火、延伸温度和时间的优化，最后确定测序引物RT-PCR的循环条件为：94 ℃预变性5 min后，进入94 ℃变性30 s，退火58 ℃，30 s，72 ℃延伸30 s的循环，共循环30次。然后72 ℃再延伸10 min，4 ℃结束。

用所建立的鲤春病毒血症病毒测序引物RT-PCR方法，扩增鲤春病毒血症病毒病毒核酸，检测结果均扩增出与试验设计相符的目的条带(138 bp)，电泳结果见图3。

图3 电泳结果M:DNA标准DL2000; 1,2:鲤春病毒血症病毒; 3:阴性对照.

2.3 焦磷酸测序结果

鲤春病毒血症病毒的RT-PCR产物，经焦磷酸测序反应，所测序列为“TGGGGGCGAATGCAGA”(图4)，与设计的指纹序列一致。

图4 鲤春病毒血症病毒测序结果

2.4 特异性测定

将鲤春病毒血症病毒的特异性测序引物分别与病毒性出血性败血症病毒、流行性造血器官坏死病毒、传染性胰脏坏死病毒、牙鲆弹状病毒、病毒性神经坏死病毒、传染性造血器官坏死病毒和锦鲤疱疹病毒的RA模板进行RT-PCR扩增及焦磷酸测序，只有与特异性引物相吻合的鲤春病毒血症病毒RNA模板得到预期扩增片段大小(138 bp，图5)及相应峰型，其余病毒均未得到特异性条带及和已知序列吻合的峰型，由此鉴定了引物设计的特异性。

图5 鲤春病毒血症病毒焦磷酸测序特异性扩增结果M:DNA标准DL2000；1:鲤春病毒血症病毒； 2:传染性造血器官坏死病毒； 3:病毒性出血性败血症病毒； 4:流行性造血器官坏死病毒； 5:牙鲆弹状病毒； 6:传染性胰脏坏死病毒；7:病毒性神经坏死病毒；8:锦鲤疱疹病毒； 9:阴性对照.

2.5 灵敏度测试

将鲤春病毒血症病毒核酸进行10倍倍比稀释后采用该焦磷酸测序方法检测，结果发现，随着核酸质量浓度的降低，测序结果随之减少。该方法对鲤春病毒血症病毒核酸的最低检出量达10 pg/μL(图6)。

图6 鲤春病毒血症病毒焦磷酸测序灵敏度结果M:DNA标准DL2000； 1:鲤春病毒血症病毒核酸 10 ng/μL； 2:鲤春病毒血症病毒核酸 1 ng/μL； 3:鲤春病毒血症病毒核酸 100 pg/μL； 4:鲤春病毒血症病毒核酸 10 pg/μL； 5:鲤春病毒血症病毒核酸 1 pg/μL； 6:鲤春病毒血症病毒核酸 100 fg/μL.

2.6 实际样品的检测

鲤春病毒血症病毒阳性检出样品数量：焦磷酸测序检测方法与常规RT-PCR方法检测结果相同，共计9批阳性，常规RT-PCR方法9批阳性，其中弱阳性2批。除2批RT-PCR弱阳性样品外，其余RT-PCR检出阳性样品均经测序确证为鲤春病毒血症病毒阳性。阳性检出样品涉及两种被采样鱼品种。检测结果见表2。

表2 鲤春病毒血症病毒焦磷酸测序检测方法与常规RT-PCR检测结果

(续表2)

编号采样地点样品名称检测结果焦磷酸测序RT-PCR38广州草鱼--39广州草鱼--40广州草鱼--41厦门黄颡鱼--42厦门黄颡鱼--43厦门黄颡鱼--44厦门黄颡鱼--45厦门黄颡鱼--46厦门黄颡鱼--47厦门黄颡鱼--48厦门黄颡鱼--49厦门黄颡鱼--50厦门黄颡鱼--51南昌鲤鱼++(弱阳)52南昌鲤鱼--53南昌鲤鱼--54南昌鲤鱼--55南昌鲤鱼--56南昌鲤鱼--57南昌鲤鱼++58南昌鲤鱼--59南昌鲤鱼++60南昌鲤鱼--61重庆鲤鱼++62重庆鲤鱼--63重庆鲤鱼--64重庆鲤鱼--65重庆鲤鱼--66重庆鲤鱼--67重庆鲤鱼++68重庆鲤鱼--69重庆鲤鱼--70重庆鲤鱼--71加拿大虹鳟--72加拿大虹鳟--73加拿大虹鳟--74加拿大虹鳟--75加拿大虹鳟--76加拿大虹鳟--77加拿大虹鳟--78加拿大虹鳟--79加拿大虹鳟--80加拿大虹鳟--

3 讨 论

本试验建立了鲤春病毒血症病毒的焦磷酸检测方法，并对其进行了反应条件的优化。该方法为国内外首次建立鲤春病毒血症病毒焦磷酸检测技术。

3.1 焦磷酸测序检测方法与传统检测方法的比较

世界动物卫生组织对于鲤春病毒血症病毒推荐的检测方法为病毒分离与RT-PCR方法。病毒分离需要建立合适的水生动物细胞系，即使已有构建好的细胞系，还需对细胞进行传代、冻存等操作。在进行病毒分离时，需要将样品溶液进行倍比稀释，每个稀释度接种细胞，观察7 d为一代。如果这一代细胞没有出现细胞病变则需要盲传第二代，还需观察7 d。病毒分离方法总计需要约14 d的时间，操作繁琐，周期较长，不适合口岸对大量进出境水生动物快速检疫的需求。

对于RT-PCR方法来说，由于灵敏度有限及其引物在扩增时可能产生错配导致非特异性结合，检测结果会存在假阳性、假阴性和非特异性扩增，为保证结果的准确性，世界动物卫生组织和我国出入境检验检疫行业标准明确规定需要对PCR产物进行测序。测序需要送到专门的生物公司，检测周期较长。本研究建立的焦磷酸方法耗时短，一般3～4 h就可以出结果，并且以具体序列为检测结果，这杜绝了假阳性的出现。本研究利用建立的鲤春病毒血症病毒焦磷酸检测方法对我国国内养殖鱼与进口鱼80份样本进行检测，涉及鲤鱼、草鱼、黄颡鱼、大菱鲆、虹鳟等多个品种，进行了鲤春病毒血症病毒的检测，草鱼曾经在我国出口鱼类养殖业中占据重要地位，而鲤鱼是近些年常有疫病检出的主要宿主鱼。将检测结果与世界动物卫生组织推荐的常规RT-PCR方法相对比，结果可以看出，焦磷酸方法对于常规RT-PCR方法的弱阳性样品样本有明显的检出，且检测结果与PCR方法完全一致，因而可以有效的证明，焦磷酸方法的高灵敏度是有效的，避免了假阳性检出。而常规PCR检测方法检出的弱阳性样品，由于不能满足测序对样本含量的要求，因而不能进行有效测序，参照世界动物卫生组织水生动物疫病诊断手册和我国检验检疫行业标准，由于不能进行有效测序，因而不能作为疫病阳性检出确诊的依据。

3.2 焦磷酸检测方法的核心设计

焦磷酸测序方法的核心是设计特异性的测序引物与指纹序列。据文献所述[13]，焦磷酸测序时，测序引物5′末端特异性无严格要求，而3′段需要与目的核酸序列完全互补。本研究所设计的测序引物的5′末端与3′末端DNA熔解温度值一致，因而引物两端可以同时与模板结合，具有一致性，有利于提高检测的准确率。指纹序列的设计需要通过比对病毒各个基因的序列，选择最为保守的一段序列。因为焦磷酸测序技术不能测过长的片段，指纹序列应该选择20 bp以内的长度。

本研究建立的焦磷酸测序技术结合PCR的灵敏度和DNA测序技术的精确度两方面的优势，测序引物与指纹序列高度保守的情况下，对一段短序列进行测序，检测结果直观可见、操作简便、检测周期短。

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DevelopmentofPyrosequencingMethodforDetectingSpringViremiaofCarpVirus

LIU Yao1，YIN Weili2，ZHANG Sihua3，YUE Zhiqin4，SUN Tao4

( 1. Rongcheng Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Rongcheng 264300，China；2. Inspection and Quarantine Center of Yantai Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Yantai 264000，China；3.Wuhan Center For Animal Disease Control and Prevention，Wuhan 430003，China；4. Technical Center of Shandong Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Qingdao 266002，China )

By collecting the sequences of spring viremia of carp virus (SVCV), the fingerprint sequences and the sequencing primers of the virus were designed and the pyrosequencing method for detection of SVCV was established successfully. The specificity and sensitivity of the method is well, which can specifically identify the objective virus in the eight fish viruses. The method has highly sensitivity and the minimum nucleic acid detection limit of 10 pg/μL. The method was verified by the detection of SVCV in 80 batches of the samples collected from domestic and imported fishes. The results indicate that the pyrosequencing method can effectively detect the false negative and weakly positive samples, while the traditional method RT-PCR cannot detect them in these situations. The specificity and sensitivity of the method meet the requirement for detection of aquatic animal diseases.

spring viremia of carp virus(SVCV); pyrosequencing; detection

10.16378/j.cnki.1003-1111.2017.04.008

S948

A

1003-1111(2017)04-0449-07

2016-07-01；

2016-09-23.

国家质检总局科研项目(2015IK195).

刘瑶(1980—)女，工程师；研究方向：海水养殖. E-mail: 13561863668@163.com.通讯作者：尹伟力(1982—)男，高级兽医师；研究方向：兽医学. E-mail: vi123vi@163.com.