葛立傲，禹利芳，伍建榕，刘林妹，马焕成，王以静

( 1.西南林业大学林学院 云南省高校森林灾害预警控制重点实验室，云南 昆明 650224； 2.西南林业大学 国家林业局西南生物 多样性保育重点实验室，云南 昆明 650224； 3.云南省元江县林业局，云南 元江 653300)

干热河谷牛角瓜顶芽枯死病 病原鉴定及其生物学特性研究

葛立傲1，禹利芳1，伍建榕1，刘林妹1，马焕成2，王以静3

( 1.西南林业大学林学院 云南省高校森林灾害预警控制重点实验室，云南 昆明 650224； 2.西南林业大学 国家林业局西南生物 多样性保育重点实验室，云南 昆明 650224； 3.云南省元江县林业局，云南 元江 653300)

按分离—接种—再分离的柯赫法则对云南干热河谷人工栽培牛角瓜CalotropisgiganteanL.上的一种新的顶芽枯死病害进行病原菌分离、鉴定及其致病性测定,根据培养性状、形态特征及分子鉴定确定该病原菌为柱孢属Cylindrocarponpauciseptatum真菌。生物学特性研究表明：该菌生长的最佳C 源为葡萄糖,对N 源和维生素均不能很好地利用,在PDA 培养基上生长的适宜温度为15～25 ℃,最佳温度为20 ℃,最佳pH 值为6,分生孢子在相对湿度100%时萌发。可以通过控制温度和土壤pH值来降低牛角瓜顶芽枯死病的发病率，提高牛角瓜的产量。

牛角瓜;顶芽枯死病;Cylindrocarponpauciseptatum；病原鉴定；生物学特性；干热河谷

牛角瓜CalotropisgiganteanL.是萝藦科Asclepiadaceae牛角瓜属的一种常绿小灌木，整株富含乳汁，叶对生，倒卵状长圆形或者椭圆状长圆形，幼嫩的叶子背面被白色绒毛，老叶无绒毛。花淡紫色，聚伞花序，全年开花结果。

牛角瓜广泛分布在亚洲和非洲的热带、亚热带地区。在我国主要分布于四川、广西、广东、海南及云南干热河谷地区的元阳、元江、建水、东川等地。因牛角瓜的多用途，即具有药用、生物药剂、能源植物以及纺织原材料开发的价值，在干热河谷地区大规模集约化种植。国外由于树种、树龄结构单一，发生过大规模的流行病害[1-3]，国内目前对于牛角瓜的病害研究处于空白阶段。2012年9月，在云南省元阳县赛刀村牛角瓜种植基地近20 hm2内调查，发病率100%，病情指数68。作者对云南干热河谷地区元阳及元江县牛角瓜顶芽枯死病调查，通过对病原菌形态学观察及病原菌核糖体DNA ITS序列分析，确定引起牛角瓜顶芽枯死病的病原是柱孢属Cylindrocarponpauciseptatum真菌，同时研究了病原菌生物学特性[4-6]。

1 材料与方法

1.1 研究材料 在云南省元阳县赛刀村随机采集牛角瓜50株，供试菌株 2014年4月分离自野外采集的具典型顶芽枯死症状的牛角瓜病组织。

PDA培养基：马铃薯(去皮)200 g,琼脂20 g,葡萄糖20 g,水1 000 mL。用于致病性测定及生物学特性研究。

1.2 病原菌分离与纯化 将采回的牛角瓜病部组织用自来水冲洗干净，在病健交界处切取5 mm×5 mm的组织块，放于75%的酒精中浸泡10～20 s，取出放入0.1%升汞溶液浸泡3～5 min，用蒸馏水清洗3～4次，除去残留的消毒剂(否则影响病菌生长),接种到PDA培养基平皿中，在25 ℃黑暗条件下培养。待长出菌落后，通过挑取菌丝尖端方法对分离的病原菌进行纯化,纯化后的病原菌保存在-4 ℃冰箱，备用[8-9]。

1.3 致病性测定 将2年生的健康牛角瓜嫩叶经75%酒精表面消毒,用病叶分离所得的菌株接种。对已产孢的真菌配制成一定浓度的孢子悬浮液(40×10倍20个孢子,并掺有一些菌丝),对未产孢的真菌取菌丝块( 直径约为0.5 cm)接种[10]。

接种采用烫伤和针刺两种方法，处理组30片嫩叶,对照组为15片。针刺法用接种针刺伤表面已消毒的牛角瓜顶尖嫩叶,然后用灭过菌的棉花蘸取菌块接种上去，塑料薄膜保湿培养；对照直接用蘸灭菌水的无菌棉花接种。烫伤接种只是接种在轻微烫伤的顶尖嫩叶上，其他均与针刺法相同[11-12]。

1.4 病原菌鉴定

1.4.1 病原菌形态学鉴定 选用症状明显的牛角瓜发病组织采用徒手切片法制作临时玻片，镜检观察病原菌形态特征、显微摄影和测量[7]。

1.4.2 病原菌分子鉴定

基因组 DNA 提取：将分离和接种确定的牛角瓜芽枯病病原菌菌丝接种到新的培养皿上，25 ℃条件下培养7 d，用OMEGA 公司产品Forensic DNA kit试剂盒按步骤提取DNA，试剂盒由昆明硕阳生物公司提供。

rDNA ITS区序列扩增：用真菌核糖体基因转录间隔区的通用引物ITS1(5‘TCCGTAGGTGAACCTGCGG3′)和ITS4 (5’TCCTCCGCTTATTGATATGC3’)扩增ITS区间和5.8S rDNA。反应体系以50 μL计算：模板DNA 2 μL,引物ITS1,ITS4各1.5 μL,Mix25 μL,ddH2O 20 μL。反应程序：94 ℃预变性3 min；进入循环，94 ℃变性30 s，56 ℃退火40 s，72 ℃延伸50 s，40个循环；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。取4 μL反应产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，完成后，将胶板取出放入凝胶成像系统中，用GeneSnap软件进行拍照观察,用吸附柱式PCR产物回收试剂盒(上海博光生物科技有限公司)纯化剩余的PCR产物，提交云南硕阳生物公司测序,序列通过Genbank进行同源性比对。

测序及rDNA ITS序列分析：测序后的ITS1、ITS4 和5.8 S rDNA序列用Clustal X程序进行rDNA序列的联配(alignment)比较、编辑，然后提交GenBank。将序列与GenBank中的柱孢属的Cylindrocarponpauciseptatum的ITS1、ITS2 和5.8 S rDNA序列进行同源性比较。

1.5 生物学特性测定

(1)温度。采用平板法进行营养生长试验，采用载片法进行孢子萌发试验。温度设10，15，20，25，28，30，32，35，40 ℃共9个梯度，每个水平设5次重复，菌落测量时间为3 d，孢子萌发测定时间为12 h。

(2)湿度。采用载片法进行孢子萌发试验，湿度调节采用小容器法，调节溶液为浓硫酸，设50%,65%,70%,90%,100%共5个湿度梯度，每个梯度设5次重复。

(3)pH。采用平板法进行营养生长试验，采用载片法进行孢子萌发试验，调节pH溶液为磷酸缓冲液，pH设4，5，6，7，8，9，10共7个梯度，每个梯度设5个重复。

(4)光照。采用平板法进行促进产孢试验，设计光照时间为0，10，12，14，24 h，共5个梯度。每个梯度设5个重复，培养直至产孢为止。

(5)营养。营养生长采用平板法，用Czapek培养基分别以等碳当量的葡萄糖、乳糖、可溶性淀粉取代蔗糖，另设无碳培养基CK；氮源则以等氮当量的牛肉膏、硫酸铵取代硝酸钾，另设无氮培养基CK。孢子萌发采用载片法，共设置1%硝酸钾、1%葡萄糖、无菌水3种处理，每种处理设置5个重复。

1.6 数据分析 数据分析使用SPSS 13.0中的一元线性模型中的Univariated方法完成。

2 结果与分析

2.1 症状 发病初期顶芽基部出现褪绿并呈水渍状，逐渐发展为黄色至暗褐色病斑，不久，顶芽发黄、变褐，病芽不能展叶、开花，呈半枯死或枯死状，产生许多小黑点，后期，病害向下延伸，出现枯梢症状，在枯死部分的下方产生大量黑色霉点。病斑后期下陷，流胶，见图1。

图1 牛角瓜顶芽枯死病症状

2.2 病原菌鉴定

形态学鉴定:枯梢上的黑色霉点经徒手切片、显微观察，鉴定牛角瓜顶芽枯死病的病原菌为柱孢属Cylindrocarponpauciseptatum真菌，有性世代为赤壳属Nectriasp.。

分离培养病原菌形态特征：在PDA 上生长很快、无色或淡色,菌落呈柔软的绒毛状、毡状,以单梗或分生孢子座方式产孢。瓶梗圆柱形或针形,具有开放的顶孔和短的领状物,从中产生无色、壁光滑的粘质状分生孢子。大分生孢子,圆柱形,两端钝圆,直或弯曲,有1个或多个横隔膜。

分子鉴定：病原菌用ITS-PCR引物进行序列测定，获得660 bp的扩增片段序列。在GenBank上blast，发现病原菌株与序列柱孢属的Cylindrocarponpauciseptatum(GenBank登录号为JF735305)同源性极高，相似性达99%，进一步证实了分离于牛角瓜的顶芽枯死病病原菌是柱孢属Cylindrocarponpauciseptatum。

2.3 致病性测定 病原菌C.pauciseptatum经人工接种,9 d后在嫩叶上产生变色反应,15 d后发病症状与采集的人工林牛角瓜顶芽枯死病的症状基本一致,切片镜检发现，病部组织内有菌丝存在。同时将发病嫩叶进行病原分离,仅得到1种真菌,与Cylindrocarponpauciseptatum的培养性状相同,病原菌再经分子检测与前相同。

2.4 病原菌生物学特性

2.4.1 温度对病原菌菌丝生长的影响 由图2可见，牛角瓜顶芽枯死病病原菌C.pauciseptatum在5～35 ℃下均能生长,适温为15 ～ 25 ℃,最适为20 ℃;低于10 ℃或者高于35 ℃时，可以明显看到菌落直径急剧减小。

图2 不同温度对病原菌生长的影响

2.4.2 光照对病原菌菌丝生长的影响 在持续光照条件下菌落生长非常好，黑暗或间断性光照条件下，生长的菌落直径只是持续光照的三分之一，可见持续光照对该菌株生长有明显的促进作用(图3)。

图3 光照对病原菌的影响

2.4.3 酸碱度对病原菌的影响 该病原菌生长的pH 值范围在3～10,适宜的pH 值为5～7,最适pH 值为6.2 左右；因此，病原菌适合在弱酸性环境中生长，强酸性或者强碱性的环境都不适合，甚至无法生长。在弱酸性和弱碱性的环境中可以生长，并且随着酸碱性的增加生长速度减弱，生长的菌落直径也减小(图4)。

图4 不同酸碱度对病原菌的影响

2.4 不同碳源对病原菌的影响 病原菌菌株在不同碳源的几种培养基上都可以生长，并且生长良好，但相比之下，乳糖制成的培养基对该病原菌生长有较明显的抑制作用(图5)。

注：图中R，ZT，KR，M，G分别表示用乳糖、蔗糖、可溶性淀粉、麦芽

糖、甘露醇代替葡萄糖的Czapek培养基

图5不同碳源对病原菌的影响

3 结论与讨论

经过致病性测定、形态学和分子生物学鉴定，确定牛角瓜顶芽枯死病病原菌为柱孢属的Cylindrocarponpauciseptatum。

国外柱孢属真菌C.pauciseptatum的生物学特性方面的报道比较少,国内也不多。1985年刘梅娟 等[13]报道了锈腐病菌对不同碳源、氮源的利用情况，高书砚 等[14]报道了人参锈腐菌10 个方面的生物学特性的初步研究，还没见到该菌这方面的研究[13-14]。研究表明，该病原菌在持续光照条件下生长最好；适合的酸碱度在pH6左右，最适范围pH5～7；在 15～25℃都生长良好；不同碳源(除了乳糖)的培养基中生长均良好，葡萄糖的培养基生长最好，蔗糖次之；自然光照射下生长良好,连续黑暗或间断性光照不利于生长。

鉴于该病原菌的生物学特性，在牛角瓜顶芽枯死病防控过程中，尤其圃地，可以通过控制光照条件、土壤pH值来预防牛角瓜顶芽枯死病的发生。

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ThepathogenidentificationanditsbiologicalcharacteristicsofapicalbudblightofCalotropisgiganteaninxerothermicvalleyareas/

Ge Li′ao.et al.

(Key Laboratory of Forest Disaster Warning and Control in Yunnan Higher Education Institutions,College of Forestry,Southwest Forestry University,Kunming 650224,China)

According to Koch′s postulates of isolation-inoculation-reisolation,isolation and pathogenicity identification on a new kind of disease cultivated inCalotropisgiganteanL.were carried out in the dry-hot valleys (DHV).According to cultivate character and morphological characteristics and molecular identification,column spore belongs toCylindrocarponpauciseptatum.The results showed that the best C source for the bacteria was glucose,the N source and vitamins couldn′t be utilized well,The proper temperature was 15 to 25 ℃ on PDA medium,optimum temperature was 20 ℃,optimal pH value was 6,conidium germinated only when the relative humidity was 100%.

CalotropisgiganteanL;bud blight;Cylindrocarponpauciseptatum;pathogen identification;biological characteristics;dry-hot valleys (DHV)

2016-04-15；

2016-06-07

国家林业公益行业专项“干热河谷牛角瓜人工林定向培育关键技术研究(201304810)”；国家自然科学基金项目(31260175)；云南省高校干热河谷植被恢复创新团队；“云南省重点学科森林保护学”(XKZ200905)，云南省高等学校森林病虫害综合治理教学团队

葛立傲(1991—)男，安徽芜湖人，在读硕士，主要从事园林植物保护学和资源微生物利用研究，E-mail：geliaogao@163.com

伍建榕，教授，主要从事森林病理学和资源微生物利用研究，E-mail：wujianrong63@aliyun.com。

S763.15

A

1671-0886(2017)03-0038-04

(责任编辑 杨静莉)