杨春文，金建丽，刘艳爽，金志民，刘铸

(牡丹江师范学院，黑龙江 牡丹江 157011)

鼠类标本中DNA提取方法的优化及PCR检测

杨春文，金建丽，刘艳爽，金志民，刘铸

(牡丹江师范学院，黑龙江 牡丹江 157011)

为探讨鼠类标本DNA提取方法，提取鲜样、盐渍、干制等不同处理方式保存的棕背鼠平Myodesrufocanus样本DNA，通过对mtDNA控制区序列PCR检测，经序列测定和比对分析，证明提取的DNA为目的鼠类DNA，试验方法可行。不同方法保存的鼠样本可作为科学研究资源。

方法；鼠类标本；DNA；提取方法；优化；PCR

鼠类是生物中的重要类群之一，与人类的生产生活密切相关。随着科学研究的不断进步，与鼠类相关的研究领域和技术不断扩展。已有研究表明，鼠类携带病原体200余种，其中可使人类致病的病原体达56种。口岸卫生检疫为防控疾病传播与流行，在对输入性鼠类的鉴定检测中，常遇到风干或腐败的标本，从而加大了标本检测的难度[1]；在防范外来有害生物入侵和传播途径工作中，鉴定和甄别不明鼠尸、不完整鼠体时，DNA提取方法可提供技术支撑；在鼠类资源调查和普查工作中，鉴定普查标本的种类也可以借助各种馆藏标本进行比对和DNA鉴定手段。在鼠类分类及遗传多样性研究中，经常选用历史上保留下来的标本。因此，探索鼠类标本的DNA提取方法在上述研究领域具有重要作用。关于动物DNA提取方法的研究已有许多报道[2-8]，作者对鼠类干制标本和盐渍标本的DNA提取方法进行优化，为今后利用馆藏鼠类标本及开展鼠类的分子生物学研究提供方法和基本资料。

1 材料与方法

1.1 试验材料 选用野外捕获的棕背鼠平活鼠,牡丹江师范学院标本馆藏的无霉变、无虫蛀干制棕背鼠平标本，盐渍2个月以上的棕背鼠平标本(表1)，并确保样品无其他DNA污染。

表1 棕背鼠平标本来源

1.2 基因组DNA提取方法

1.2.1 盐渍标本DNA提取

1.2.1.1 除盐 取适量样本于1.5 mL的Eppendorf管中，剪成碎块，加入1 mL的无菌水，振荡后静置5～10 min，之后将水倾出，并轻轻挤压多余水分，重复浸泡挤压5次以上。

1.2.1.2 样品消化 加入消化液：450 μL TNE+45 μL SDS+pr K(2 mg/mL) 5 μL，55 ℃水浴锅中消化一夜。

1.2.1.3 DNA提取 在消化液中加入500 μL 饱和酚，混匀10 min；5 500 rpm/min，4 ℃，离心10 min；取上清液，加入500 μL饱和酚，重复提取1次；上清液中加入500 μL氯仿，5 500 rpm/min，4 ℃，离心10 min，取上清液，重复提取1次。然后将上清液加入5 μL 10 mg/mL的RNase，37 ℃恒温水浴30 min，加1 000 μL冷冻的无水乙醇，轻混，放入-70 ℃超低温冰箱2 h后取出，13 000 rpm/min，4 ℃，离心15 min。弃去乙醇，加入适量的TE，待DNA溶解后，混匀，放入4 ℃冰箱保存。

1.2.2 干制标本DNA提取 干制标本的预处理参照文献[7]并作适当改进。剪标本皮肤约0.4 cm2(约0.1 g)，剪碎至1 mm2以下，置于Eppendorf管中，加入500 μL无水乙醇，振荡后静置30 min，4 500 rpm /min离心6 min，去上清液；无菌水振荡，4 500 rpm /min离心6 min，去上清；重复3次以上。加入500 μL浸泡液(10 mmol/L Tris-HCl，200 mmol/L EDTA，50 mmol/L NaCl，pH 8.0)，室温放置最好5～6 h，4 500 rpm /min离心6 min，倾去上清液。加入500 μL去离子水，振荡，6 000 rpm/min离心6 min，倾去上清，快速重复2次。

经以上方法处理好的样本按1.2.1.3盐渍样品DNA提取方法提取DNA。

1.2.3 新鲜标本DNA提取 按1.2.1.3盐渍样品DNA提取方法提取新鲜标本DNA。

1.2.4 mtDNA-PCR扩增反应 对提取的棕背鼠平样本的mtDNA控制区序列进行PCR扩增[9]。反应体系:10 μL，含200 μmol/L的dNTP，1.5 mmol/L的MgCl2，引物各2 pmol，Taq DNA聚合酶0.5 U，模板DNA 100 ng。所用引物为上海生物工程有限公司合成，rTaq购于大连宝生物公司。

PCR扩增程序：94 ℃ 预变性3 min，94 ℃ 变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30个循环后72 ℃延伸7 min。

2 结果与分析

2.1 琼脂糖凝胶电泳检测 对提取的棕背鼠平标本mtDNA控制区序列进行PCR扩增，产物在1%的琼脂糖凝胶中电泳，电压90 V，40 min，Goldview染色，凝胶成像系统下观察(图1)。

注：a.棕背鼠平新鲜标本； b.棕背鼠平盐渍标本； c.棕背鼠平干制标本；Marker：DL-2000；a-c中的数字1～7均为鼠标本号图1 提取的DNA PCR扩增结果

2.2 棕背鼠平线粒体控制区目标序列比对 PCR产物经上海生工生物工程有限公司进行DNA测序,获得长度大于800bp的DNA序列，并与GenBank中棕背鼠平序列进行比对。结果显示，所得产物量和纯度均符合研究需要。

表1 棕背鼠平线粒体控制区目标序列比对

注：1.GenBank已知棕背鼠平线粒体控制区目标DNA序列； 2.干制标本DNA序列； 3.盐渍标本DNA序列； 4.新鲜标本DNA序列。

3 结论和讨论

细胞内DNA 含量随死亡时间延长而呈下降趋势[10]，对于陈旧标本，由于保存条件不当，长期受到物理、化学、生物降解等方面的作用，加大了DNA的提取难度。Carsten M指出：由于非新鲜标本中DNA大多断裂为较小片段，所以一般扩增的DNA片段不应太长，扩增的目标片段以低于500bp为宜[11]。本研究在鼠类标本DNA提取方法上参考了相关的研究报道，并针对不同保存方法的鼠类样本进行相应处理：盐渍样本重点放在DNA提取前的除盐过程，根据盐渍时间和相应的NaCl用量适当增加用水浸泡的时间和除盐次数，避免过多NaCl干扰DNA提取结果；干制标本的预处理过程重点放在标本的软化阶段，预处理用无水乙醇浸泡，去除皮肤表层残留的脂溶性成分，并达到对标本的清洗及消毒作用，以避免脂肪的残留影响标本与浸泡液和消化液的充分接触而造成消化不完全，从而降低DNA的提取量，浸泡液对标本的浸泡时间最好5～6 h，之后，用高浓度Na盐浸泡液浸泡，软化组织，减少消化时间，高浓度金属离子并可抑制DNA的降解。无水乙醇浸泡和浸泡液浸泡两个步骤，减少基因组DNA提取过程中可能造成的机械断裂[12]是方法的关键。

分别采用不同的处理方法，提取新鲜、盐渍、干制等不同处理方式保存的鼠类样本DNA，设置空白对照以及阳性对照，对提取的DNA经PCR扩增后对线粒体控制区目标序列(可用于分析比对序列长度800 bp)进行比对分析，并将扩增出的线粒体控制区目标序列与Genbank中的数据相比对，证明了所提取DNA的准确性。结果表明，选用适当方法，从不同处理方法保存的鼠类标本中提取的DNA，完全能够满足分子生物学研究的需要。

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PCRdetectionandoptimizationofDNAextractioninrodentspecimens/

YANG Chunwen,et al.

(Mudanjiang Normal University,Mudanjiang 157011,China)

In order to study the DNA extraction method,the DNA samples were extracted from fresh,salted,dried specimens ofMyodesrufocanus.By PCR detection and analysis of mtDNA control region sequence,the results showed that DNA extractives were the DNA of target rodent and the test method was feasible.The rodent specimens with different preservation methods can be used as resources for scientific research.

method;rodent specimen;DNA;extraction method;optimization;PCR

2016-11-14；

2016-12-09

黑龙江省高校科技创新团队项目“森林啮齿动物种群崩溃机理及控制技术研究”；黑龙江省教育厅科学技术项目(12541833)

杨春文(1958— )，男，黑龙江兰西人，教授，主要研究方向动物生态学。

S764.5

A

1671-0886(2017)03-0019-03

(责任编辑 李海燕)