张武霞，陈露，段金友*

(1.山西农业大学 文理学院，山西 太谷 030801； 2.西北农林科技大学 化学与药学院，陕西 杨凌 712100)

三种中药多糖的抗抑郁活性及其机制研究

张武霞1，陈露2，段金友2*

(1.山西农业大学 文理学院，山西 太谷 030801； 2.西北农林科技大学 化学与药学院，陕西 杨凌 712100)

[目的]寻找新型高效的抗抑郁药物是一项紧迫的工作。本研究从石菖蒲、白芍和茯苓3种具有抗抑郁作用的中药中分别提取中药多糖，命名为ATSP、PLPP和PCWP，并进一步研究其抗抑郁抗氧化作用及其机制。[方法]采用小鼠强迫游泳、悬尾和慢性应激反应模型评价三种中药多糖的抗抑郁活性，通过测定DPPH和羟基自由基清除率，还原能力以及脂质抗氧化能力研究三种中药多糖的抗氧化活性。[结果]三种中药多糖显著减少小鼠强迫游泳和悬尾试验中的不动时间；在慢性应激反应中，可以有效防止抑郁小鼠脑组织中5-羟色胺含量的减少，同时可以阻止脑组织中超氧歧化酶的增加；体外抗氧化结果显示ATSP的半数DPPH清除浓度为(5.46±0.05) g·L-1，PCWP的半数羟基自由基清除浓度为(6.53±0.02) g·L-1，ATSP、PLPP和PCWP的半数抗脂质过氧化浓度分别为(6.06±0.16)、(6.78±0.96)、(1.81±0.09) g·L-1，表明三种多糖均具有一定的抗氧化能力。[结论]本研究所得到的三种中药多糖具有明显的抗抑郁效果，其作用机制可能和其抑制5-羟色胺的再摄取及显著的抗氧化能力有关，可作为抗抑郁候选药物。

石菖蒲； 白芍； 茯苓； 多糖； 抗抑郁

抑郁症是人类最普遍的健康问题之一，是一种与神经免疫关系密切相关的精神疾病，会严重影响人的思想、行为、感情和身体健康[1]。目前，用来治疗抑郁症的药物主要包括：选择性5-羟色胺再摄取抑制剂(SSRIs)、三环类抗抑郁药、单胺氧化酶抑制剂和去甲肾上腺素再摄取抑制剂[2]。然而，这些药物的治疗效果通常不能持续，并且伴随冷漠、镇静、认知障碍、睡眠障碍和性功能障碍等副作用[3]。因此，开发新型高效低毒的抗抑郁药物尤为重要。

中药副作用小、毒性低，近年来关于中药治疗抑郁症的研究受到越来越多的关注。许多中药复方及单药被发现具有抗抑郁效果，如研究发现逍遥散、半夏厚朴汤等复方具有明显的抗抑郁效果；茯苓、柴胡、石菖蒲、白芍、黄芪、巴戟天、刺五加以及银杏等单味中药在小鼠强迫游泳和小鼠尾悬挂试验等行为绝望模型中表现出显著的抗抑郁症疗效[4]。尽管中药治疗抑郁症的效果显著，但是关于中药治疗抑郁症物质基础和作用机制研究非常有限，严重阻碍抗抑郁中药的开发及其临床优势的发挥。目前对中药有效的成分研究大部分集中在小分子化合物上，对多糖成分活性的研究较少，而实际上多糖是中药水煎剂的主要成分之一。多糖是一类具有抗肿瘤、免疫调节、抗氧化和降血糖等多种生物活性功能的大分子化合物[5]，近年来一些研究者开始关注多糖抗抑郁活性的研究。考虑到中药多糖副作用小，毒性低，其在治疗抑郁症方面具有巨大潜力。

本研究中，我们以具有抗抑郁活性的三种传统中药石菖蒲、白芍和茯苓为目标，提取中药多糖，通过一系列抑郁症动物模型研究中药多糖抗抑郁能力，并进一步通过测定动物脑组织中5-羟色胺(5-HT)和超氧岐化酶(SOD)含量，以及中药多糖的抗氧化能力，探索中药多糖抗抑郁的作用机制。

1 材料与方法

1.1 中药材和化学试剂

干燥的石菖蒲、白芍和茯苓中药购自中国陕西省杨凌区大药房。帕罗西汀(paroxetine)为浙江淮海制药公司生产，其他药物试剂购买自上海阿拉丁公司。

1.2 试验动物

试验用昆明小鼠购买自西安交通大学，雄性，体重18～22 g，动物分笼饲养，室温(22±1)℃，食物和水自由摄取。

1.3 试验方法

1.3.1 中药粗多糖的提取和纯化

用粉碎机将石菖蒲、白芍和茯苓粉碎成粉末，加入95%脱脂，用10倍体积的蒸馏水在80 ℃ 条件下加热提取2 h，离心取上清液，共提取三次，合并上清液，浓缩。浓缩液加四倍体积无水乙醇进行沉淀，并在4 ℃放置24 h。收集沉淀，用Sevag法除去蛋白质，5% H2O2脱色，最后透析冻干，得到三种中药多糖石菖蒲多糖(ATSP)，白芍多糖(PLPP)和茯苓多糖(PCWP)。

1.3.2 多糖化学组成分析

以D-葡萄糖为标准品，用苯酚硫酸法测定多糖中性糖含量[6]；以半乳糖醛酸为标准品，用间羟基联苯法测定糖醛酸含量[7]；以牛血清蛋白(BSA)为标准品，用考马斯亮蓝显色法测定蛋白质含量[8]。

1.3.3 多糖抗抑郁活性评价

通过经典的抗抑郁模型开野试验(OFT)、悬尾试验(TST)和强迫游泳试验(FST)评价多糖的抗抑郁活性。

开野试验：开野试验用来评价多糖对小鼠的自由活动行为的影响[9]，将灌胃给药多糖14 d后的小鼠放在一个箱子里，长×宽×高为45 cm×45 cm×30 cm。将箱子底部分为九个方格，小鼠放在中心位置，观察小鼠5 min内的移动行为。

悬尾试验：参照 Mantovani等人的方法[10]，将小鼠随机的分为八组，每组10只，分别灌胃给药高低剂量的ATSP，PLPP或PCWP 多糖溶液(50、300 mg·kg-1·d-1)，灌胃给药30 mg·kg-1帕罗西汀作为阳性对照组，正常对照组灌胃等量蒸馏水。灌胃给药14 d后，在一个离地面50 cm的暗盒内，将小鼠尾端1 cm的部位用胶带悬挂，头部离箱子底部5 cm。比较各组小鼠在 6 min内累计不动时间。

强迫游泳试验：将小鼠随机的分为八组，每组10只，分别灌胃给药高低剂量的ATSP，PLPP或PCWP 多糖溶液(50、300 mg·kg-1·d-1)，灌胃给药30 mg·kg-1帕罗西汀作为阳性对照组，正常对照组灌胃等量蒸馏水。灌胃给药14 d后，将小鼠置于水深10 cm的玻璃杯中，水温25 ℃，观察记录6 min 内的累计不动时间。

慢性应激反应模型：参考Bhutani等人的方法[11]，我们建立了小鼠应激模型，将小鼠随机的分为九组，分别为灌胃蒸馏水的正常对照组，每天进行不同应激处理的抑郁模型组和灌胃给药高低浓度多糖以及药物的抑郁处理组(50 或 300 mg·kg-1·d-1的ATSP、PLPP、PCWP或者30 mg·kg-1·d-1的帕罗西汀)。应急处理21 d之后，处死小鼠，冰浴条件下取出大脑并在-80 ℃保存。将脑组织加4倍生理盐水匀浆，12,000 × g 离心20 min，收集上清液测定5-HT和SOD的含量。5-HT测定试剂盒购买自上海鑫乐生物科技有限公司，SOD购买自南京建成生物科技有限公司。

1.3.4 体外抗氧化活性测定

DPPH自由基的清除：将不同浓度的多糖溶液加入到用95%乙醇配制的DPPH (0.1 mM, 4.0 mL)中，摇匀之后室温反应30 min，用分光光度计在517 nm处测定吸光度值[12]。

DPPH清除率(R) 计算如下:

(1)

还原力的测定：不同浓度的多糖溶液中加入1 mL磷酸缓冲液(0.2 M, pH 6.6)和1 mL 0.1%铁氰化钾，混合后在50 ℃下孵育20 min，再加1 mL 10%三氯醋酸溶液，3000 rpm离心10 min。取1 mL上层溶液，加入1 mL蒸馏水和0.2 mL 0.3%三氯化铁溶液， 700 nm处测定吸光度值[13]。

羟基自由基清除率：0.5 mL的水杨酸-乙醇溶液(9.1 mM)，0.5 mL的多糖水溶液，0.5 mL 的FeSO4 溶液(9.1 mM) 和 3.0 mL的蒸馏水混合，在上述混合液中加入3.0 mL H2O2(8.8 mM)，510 nm处测定吸光度值[14]。

羟基自由基清除率(R) 计算如下:

hydroxyl radical scavenging rate(%)

(2)

脂质过氧化抑制作用：参考Liu等人[15]通过与硫代巴比妥酸反应测定多糖脂质过氧化抑制作用。1.0 g 小鼠肝脏匀浆加100.0 mL蒸馏水。取1.0 mL肝脏匀浆，加0.2 mL多糖样品，再加50 μL FeCl2溶液(0.1 mM) 和H2O2(0.1 mM) 37°C 反应1 h。加0.3 mL三氯乙酸(20%, w/v)和硫代巴比妥酸(0.8%, w/v)，100 ℃反应 15 min，4 000 rpm离心10 min，532 nm测吸光度值。计算脂质过氧化抑制作用：

lipid peroxidation inhibitory effect(%)

(3)

1.4 数据统计分析

结果用平均值±SD来表示，数据通过GraphPad Prism软件的t-检验和单因素方差分析进行处理。

2 结果分析

2.1 三种中药多糖ATSP，PLPP和PCWP的分离提取和化学成分分析

通过水提醇沉法得到的中药多糖ATSP、PLPP和PCWP的产率分别为2.04%、4.45%和0.56%。如表1，ATSP、PLPP和PCWP的中性糖含量分别为(80±2.13)%，(91±1.89)%和(88±0.76)%。糖醛酸(<6%)和蛋白(<3%)含量非常低，表明提取物主要成分为多糖。

表1三种中药多糖的主要化学成分

Table1 Major chemical content of the polysaccharides from three Chinese medicine

石菖蒲多糖ATSP白芍多糖PLPP茯苓多糖PCWP中性糖含量/%8000±2139100±1898800±076蛋白质含量/%225±014181±009241±015糖醛酸含量/%238±006510±021568±012

2.2 ATSP，PLPP和PCWP具有抗抑郁活性

抑郁症是一种常见的情感性精神障碍，世界上约有21%的人受到抑郁症的困扰[16]。动物模型有助于科学家深入研究这种精神疾病，进而开发新的抗抑郁药物[17]。

本研究中，我们用TST和FST两种急性短期模型来检测多糖的抗抑郁活性，为了排除中药多糖对小鼠自由活动的影响，我们首先以开野试验检测中药多糖对小鼠自由活动的影响，结果表明试验用的不同剂量多糖和阳性药无帕罗西汀对小鼠的自由移动均无显著影响(图1A)。

如图1B所示，在TST试验中，阳性对照药物帕罗西汀可以明显的减少悬尾小鼠的不动时间(p<0.001)，在相同的试验条件下，多糖ATSP、PLPP和PCWP灌胃给药小组小鼠的悬尾不动时间也明显减少，说明其具有一定的抗抑郁作用，三组多糖在相同浓度下的效果接近，无显著性差异，同种多糖样品给药浓度越高，抗抑郁效果越明显。

在FST试验中(图1C)，帕罗西汀可以明显的减少小鼠游泳过程的不动时间(p<0.001)，类似的，三种中药多糖也可以显著降低小鼠游泳过程的不动时间，石菖蒲多糖ATSP和茯苓多糖PCWP给药300 mg·kg-1的效果要优于50 mg·kg-1，但白芍多糖PLPP在两种不同浓度给药条件下没有显著性差异。三组多糖在相同浓度下的效果接近，无显著性差异。综合以上模型结果，三种中药多糖均具有显著的抗抑郁作用。

图1 石菖蒲多糖、白芍多糖和茯苓多糖的抗抑郁活性：(A)开野试验中小鼠的自由或活动能力；(B)悬尾试验过程中小鼠的不动时间；(C)强迫游泳试验过程中小鼠的不动时间。结果用平均值±SD (n=10)表示。(***)，(**)和(*)分别表示和正常组相比P<0.001，P<0.01和P<0.05。Fig.1 Antipress effects of oral administration of ATSP, PLPP and PCWP: (A) Locomotor activity in the open field test (OFT); (B) The duration of immobility in the tail suspension test (TST); (C) The duration of immobility in the forced swimming test (FST). Results are expressed as mean±SD (n=10). (***) P<0.001, (**) P<0.01, and (*) P<0.05 compared with the normal control.

2.3 ATSP、PLPP和PCWP通过抑制脑组织5-羟色胺的再摄取、阻止SOD的增加实现抗抑郁作用

抑郁症患者通常伴随脑组织中5-HT含量的降低，本研究中，我们利用慢性应急模型(CUMS)检测三种中药多糖ATSP、PLPP和PCWP对抑郁小鼠脑组织5-HT的影响[18]。如表2所示，CUMS组小鼠脑组织中的5-HT水平明显下降，说明模型构建成功。在给药组中，结果显示不同剂量的三种中药多糖均可以有效抑制5-HT含量的下降，其中石菖蒲多糖ATSP和白芍多糖PLPP显示出一定的浓度依赖性，浓度越高，抑制效果越好，而茯苓多糖PCWP在两种给药浓度作用下差异不显著，相同浓度下不同多糖效果区别不明显。以上结果暗示三种中药多糖的抗抑郁活性可能和其调节脑内5-HT含量的能力有关。

表2三种中药多糖对慢性应激模型(CUMS)小鼠脑组织中5-HT和SOD含量的影响

Table2 Effects of polysaccharides on the 5-HT and SOD level in the brains of chronic unpredictable mild stress (CUMS) mice.

注：结果用mean±SD 表示，每组10只小鼠: (###)表示和对照组相比p<0.001；(***)，(**)和(*)分别表示和慢性应激反应模型组相比P<0.001，P<0.01和P<0.05。

Note: The values are reported as the mean±SD of ten mice per group: (###)P< 0.001 compared with normal control; (***)P<0.001, (**)p<0.01, and (*)P<0.05 compared with the CUMS treated group.

另外，已知重度抑郁症患者一般都会伴随着脑组织SOD等氧化酶活性增加[19]。在本研究中，我们同样检测了中药多糖对CUMS模型脑组织中SOD含量的影响，结果显示，模型组的小鼠脑组织中的SOD含量明显增加(表2,P<0.001)，灌胃给药不同浓度的中药多糖和帕罗西汀之后，SOD含量几乎下降到正常水平，表明三种中药多糖可以显著降低脑内SOD含量，并且茯苓多糖的作用明显强于另外两种多糖，这表明降低脑内SOD含量可能也是中药多糖抗抑郁的途径之一。

2.4 ATSP，PLPP和PCWP具有抗氧化活性

现代研究认为压力引起的精神失常和氧化损伤有着很大的关系[20]。研究表明破坏患者体内等离子体抗氧化防御系统，同时增强脂质过氧化作用，所引起的氧化应激作用会导致重度抑郁[21]。因此，我们进一步测定了中药多糖的抗氧化能力。我们综合四个抗氧化能力试验检测了中药多糖ATSP、PLPP和PCWP的抗氧化作用。

2.4.1 中药多糖自由基清除能力

如图2A所示，石菖蒲多糖ATSP表现出最强的DPPH自由基清除能力(IC50=(5.46±0.05) g·L-1，活性具有浓度依赖性，白芍多糖PLPP的DPPH自由基清除能力弱于ATSP，但强于茯苓多糖PCWP。

2.4.2 中药多糖的还原力

通过测定样品多糖对铁离子的还原力可以反映其抗氧化能力[22]。图2B显示了三种中药多糖还原力的剂量反应曲线，当样品浓度为10 g·L-1时，ATSP，PLPP和PCWP 的还原力对应的吸光度值分别为0.54，0.43和0.25。表明ATSP和PLPP的抗氧化能力较强。

2.4.3 中药多糖的羟基自由基清除能力

在机体内的羟基自由基通常被认为是有毒的，能够自由的穿过细胞膜，到达特定的组织部位，从而引起组织损伤和细胞死亡。因此，清除羟基自由基对于保护生物体的生命系统是非常重要的[23]。如图2C所示，茯苓多糖PCWP表现出很强的羟基自由基清除能力(IC50=(6.53±0.02) g·L-1)，并且具有浓度依赖性。

2.4.4 中药多糖的脂质过氧化抑制作用

脂质，尤其是细胞膜上的不饱和脂肪酸，对于酶和非酶氧化剂非常敏感，容易被自由基氧化，从而导致膜损伤引起各种紊乱性疾病[24]。抗氧化剂可以直接和自由基或者脂质过氧化物反应，同时可以抑制活化自由基的形成。如图2D所示，2 g·L-1的茯苓多糖PCWP对脂质过氧化的抑制率就达到了50%，而ATSP和PLPP在同样浓度下的抑制率分别为40.30%和38.30%。

图2 石菖蒲多糖、白芍多糖和茯苓多糖的抗氧化能力: (A) DPPH自由基清除率；(B)还原力；(C)羟基自由基清除率；(D)脂质过氧化抑制作用。结果用三组平行试验的平均值±SD表示。Fig.2 Antioxidant activities of ATSP, PLPP and PCWP: (A) scavenging of DPPH radicals; (B) reducing power; (C) scavenging of hydroxyl radical; (D) inhibitory effect on lipid peroxidation. The values are reported as the mean±SD of three separate experiments.

3 讨论与结论

抑郁症会影响人的家庭、工作、睡眠、饮食习惯和身心健康。在我国，治疗抑郁症的方法非常有限，心理疗法和药物治疗对患者来说比较难实现[25]，我国中药资源丰富，利用中药治疗抑郁症具有巨大潜力。研究表明石菖蒲、白芍和茯苓均具有抗抑郁活性，但其物质基础尚不清楚。当前关于中药活性物质基础研究大多数集中在小分子化合物的研究，对中药多糖的研究非常有限。本文中，我们系统研究了这三种中药的多糖成分ATSP，PLPP和PCWP的抗抑郁作用，结果显示，和帕罗西汀类似，三种中药多糖均具有显著的抗抑郁能力，其机制可能与中药多糖能够抑制脑神经对5-HT再摄取，同时阻止抑郁小鼠大脑中SOD含量的增加有关。

另外，已知活性氧与许多疾病的发病机制相关，例如癌症，心血管疾病，动脉粥样硬化，老年痴呆症，衰老以及一些精神疾病[26]。研究表明活性氧能够调节去甲肾上腺素、5-羟色胺、多巴胺和谷氨酸等抑郁疾病相关的神经递质的含量和活性[27]。研究表明患有重度抑郁症的人脑内SOD水平会高于正常健康人[28]，因此，可以通过抗氧化药物调节，防止氧化损伤，使患者体内的SOD降到正常水平可以达到治疗抑郁的效果。天然植物多糖通常具有一定的自由基清除能力[29]。本研究体外抗氧化试验结果显示：ATSP 表现出比较强的DPPH自由基清除能力(IC50=(5.46±0.05) g·L-1)，多糖PCWP 具有明显的羟基自由基清除能力(IC50=(6.53±0.02) g·L-1)。ATSP，PLPP和PCWP还具有脂质过氧化抑制作用和还原能力。这些结果暗示这三种中药多糖可以利用抗氧化能力改善抑郁症。

如今，开发更具耐受性更有效的抗抑郁药物是该领域的一个非常迫切任务，中药多糖因为其温和低毒，是一种良好的候选药物，应该受到更多的关注和研究。本文研究了中药多糖抗抑郁作用及其可能的机制，为多糖抗抑郁药物的开发提供了基础。

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Studyontheantidepressantactivitiesofpolysaccharidesfromthreeherbsandtheirmechanism

ZhangWuxia1,ChenLu2,DuanJinyou2*

(1.CollegeofArtsandSciences,ShanxiAgriculturalUniversity,Taigu, 030801,China; 2.Collegeofchemistryandpharmacy,NorthwestAgriculturalandForestryUniversity,Yangling712100,China)

[Objective]Pursuit of novel effective antidepressants is an urgent task.AcorustatarinowiiSchott,PaeonialactifloraPall andPoriacocos(Schw.) Wolf are three traditional herbs with antidepressant effects. Polysaccharides designated ATSP, PLPP, PCWP were extracted fromAcorustatarinowiiSchott,PaeonialactifloraPall andPoriacocos(Schw.) Wolf, respectively.[Methods]Their antidepressant activities were evaluated by tail suspension test (TST), forced swimming test (FST) and chronic unpredictable mild stress (CUMS) model of depression. Male Kunming mice were randomly divided and pre-treated orally with ATSP, PLPP or PCWP (50 and 300 mg·kg-1·d-1) for 14 days. Their antioxidant activities were analyzed by monitoring their DPPH and hydroxyl radical scavenging potential, reducing power and inhibition of lipid peroxidation.[Results]Three polysaccharides significantly decreased the immobility duration of animals in TST and FST, rescued 5-hydroxytryptamine reduction and prevented superoxide dismutase increment in the CUMS model of depression at both doses above. Antioxidant experiments showed that ATSP exhibited DPPH radical scavenging activity with an IC50of (5.46±0.05) g·L-1. PCWP exhibited scavenging activity on hydroxyl radical with an IC50of (6.53±0.02) g·L-1. ATSP, PLPP and PCWP exhibited inhibitory effects on lipid peroxidation with IC50of (6.06±0.16), (6.78±0.96) and (1.81±0.09) g·L-1, respectively and all of them had moderate reducing power.[Conclusion]Our result demonstrated that ATSP, PLPP and PCWP might be suitable for developing antidepressive or antioxidative pharmaceuticals.

AcorustatarinowiiSchott,PaeonialactifloraPall,Poriacocos(Schw, ) Wolf, Polysaccharides, Antidepressant activity

R284

A

1671-8151(2017)12-0905-09

2017-07-07

2017-08-26

张武霞(1989-)，女(汉)，山西大同人，讲师，博士，研究方向：多糖分离及活性

*通信作者：段金友，教授，博士生导师，Tel：029-87092226；Email：jduan@nwsuaf.edu.cn

国家自然科学基金面上项目(31270860)

(编辑：张莉)