王鹏丽，任建宏，王晓璐，王育选，赵娟

(山西农业大学 农学院，山西 太谷 030801)

纳米碳对平陆百合脱毒苗鳞片分化的影响

王鹏丽，任建宏，王晓璐，王育选，赵娟*

(山西农业大学 农学院，山西 太谷 030801)

[目的]研究不同浓度纳米碳对平陆百合鳞片分化的影响，旨在优化筛选分化培养基的同时，为纳米碳应用于植物组织培养提供参考依据。[方法]以平陆百合脱毒苗鳞片为外植体，采用正交试验设计法研究了植物激素与不同浓度纳米碳配比对诱导平陆百鳞片分化的影响。[结果]6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)、萘乙酸(NAA)和不同浓度纳米碳配比时，鳞片分化的最佳培养基为MS+6-BA 0.5 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1+纳米碳800 mg·L-1，分化率达98.09%；玉米素(ZT)、吲哚丁酸(IBA)和不同浓度纳米碳配比时，鳞片分化的最佳培养基为MS+ZT 0.8 mg·L-1+IBA 0.3 mg·L-1+纳米碳600 mg·L-1，分化率达91.43%。[结论]培养基中添加不同浓度的纳米碳均可促进百合鳞片的分化，不同浓度纳米碳对鳞片分化的影响程度不同，其最适宜添加浓度为600～800 mg·L-1。

纳米碳； 平陆百合； 鳞片分化

山西平陆百合(Liliumbrowniivar.viridulum)为百合科百合属多年生草本球根植物，其鳞茎富含多种人体所需的蛋白质、矿质元素等[1,2]，具有较高营养和食用价值[3,4]，不仅是很好的保健产品,且在临床上也具有医用价值的功效。快速繁殖百合脱毒苗为百合大量生产和应用提供了有效途径，鳞茎是最常用的快繁外植体，而以鳞片作为快繁的外植体，比鳞茎繁殖数量更大，繁殖系数更高，同时可避免病毒积累和种性退化，更有利于规模化、工厂化快速繁殖[5]。目前已有一些诱导百合鳞片分化的相关研究，但尚未见到纳米碳对百合鳞片分化的相关报道。

纳米技术是指研究结构尺寸在1～100 nm范围内的材料性质和应用的一项崭新技术[6]。当物质结构尺寸在此范围内时，理化性质会改变，这些材料通常被称为纳米材料，因其结构独特、性能优异而广泛应用于及医药、能源、环境、生物、农业、工业等众多领域[7～9]。纳米碳作是典型的纳米材料之一，目前已有研究表明，纳米碳在影响生物代谢、促进作物生长发育等方面具有良好的作用[10]，对于纳米碳的研究及应用主要集中在其理化性质、结构特性及改良土壤、促进作物吸水吸肥、增产等，但其对植物的生理作用、分子机制及在植物组织培养中的应用研究较少。本实验室已在金昌枣、大花蕙兰、红掌的组培快繁中开展了纳米碳应用的相关研究[11]。本试验以平陆百合鳞片为外植体，采用L16(45)正交设计法，对不同激素与不同浓度纳米碳配比诱导平陆百鳞片分化，旨在优化筛选百合鳞茎分化培养基的同时，为纳米碳应用于植物组织培养提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验用平陆百合(Liliumbrowniivar.viridulum)脱毒苗由本实验室前期试验获得。

6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)由天津市光复精细化工研究所提供，萘乙酸(NAA) 上海化学试剂采购供应站经销提供，玉米素(ZT) 大连美仑生物技术有限公司提供，吲哚丁酸(IBA)由天津石英钟长霸州市化工分厂，纳米碳(C>90%，粒径40～80 nm)由山西华农纳米科技有限公司提供。

1.2 试验方法

以前期试验筛选出的诱导百合鳞片分化效果较好的激素种类和配比为基础，采用L16(45)正交设计法进行纳米碳对百合鳞片分化的影响研究，试验因素及水平见表1。选用平陆百合外层鳞片作为外植体，以平铺方式接种，每组7瓶，每瓶接种5块鳞片，重复3次。每周观察并记录鳞片分化及生长情况，接种40 d后统计鳞片分化率。

1.3 培养条件

以MS为基本培养基，附加蔗糖30 g·L-1，琼脂6 g·L-1，pH为5.6～5.8。

培养温度(25±2)℃，光照14 h·d-1，光照强度2 000～3 000 lx。

表1 鳞片分化正交试验设计/mg·L-1Table 1 Scale differentiation orthogonal test design

1.4 实验数据统计方法

鳞片分化率=(发生分化的鳞片数/接种鳞片总数)×100%

使用DPS 7.05对数据进行分析；使用SPSS 17.0设计正交试验并对所得结果进行分析。

2 结果与分析

2.1 纳米碳与6-BA、NAA配比对平陆百合鳞片分化的影响

将百合鳞片以平铺放置方式接种于以下培养基，14 d后鳞片边缘切口处膨大，21 d后在膨大处有芽出现，28 d后芽形成小鳞茎，紧密排列于接种鳞片的切口处，40 d后统计结果见表2。

表2纳米碳与6-BA、NAA配比对鳞片分化的影响

Table 2 Effects of nano-carbon and 6-BA and NAA ratio on scale differentiation

编号Code因素Factors6⁃BA/mg·L-1NAA/mg·L-1纳米碳/mg·L-1分化率/%Differentiationrate1020120057142020140078093020160063814020180060955050220079056050240082867050260090488050280098099080320063811008034007333110803600885712080380071431310042005619141004400695215100460075241610048006286

由表2可见，不同浓度6-BA、NAA与不同浓度纳米碳配比时对百合鳞片分化的影响均不同。在附加相同激素的培养基中，随着纳米碳浓度的升高，鳞片分化率基本呈现先升后降的趋势；而随着激素浓度的升高，配比高浓度的纳米碳则促鳞片分化效果更好。所设处理中以处理8促分化效果最好，分化率最高，为98.09% (图1a)，且分化出的小鳞茎生长健壮；而处理13的促分化效果较差，分化率仅为56.19%(图1b)，且分化出的小鳞茎徒长。对试验结果进行极差分析(表3)，6-BA、NAA和纳米碳的极值分别是22.62、5.72和15.48，说明6-BA对平陆百合鳞片分化的影响最大，纳米碳次之，NAA的作用最小。

图1 纳米碳与6-BA、NAA配比对平陆百合鳞片分化的影响Fig.1 Nano-carbon and 6-BA、NAA ratio of flat lily scales differentiation culture 注：a培养基:MS+6-BA 0.5 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1+纳米碳800 mg·L-1；b培养基:MS+6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.4 mg·L-1+纳米碳200 mg·L-1Note: a (medium: MS+6-BA 0.5 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1+carbon nano 800 mg·L-1);b (medium: MS+6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.4 mg·L-1+carbon nano 200 mg·L-1)

运用SPSS软件对百合鳞片分化结果进行方差分析。从主体间效应检验表(表4)可以得出，在Sig=0.05水平上，6-BA对平陆百合鳞片的分化具有显著性差异，NAA和纳米碳对鳞片的分化没有显著性差异；F值：6-BA>纳米碳>NAA，表明3因素对百合鳞片分化作用的主次关系为6-BA>纳米碳>NAA，这与极差分析的结果一致。综合考虑，6-BA与NAA配比时诱导鳞片分化的最佳培养基为MS+6-BA 0.5 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1+纳米碳800 mg·L-1。

表3平陆百合鳞片分化率极差分析(直观分析)/mg·L-1

Table 3 Analysis of scale differentiation rate of lily (visual analysis)

试验因素Testfactor6⁃BANAA纳米碳水平和K1K2K3K4水平均值K1K2K3K4极值R25999291432561935048295233038029714280953181026381303812933365007286640587627381759574297024795365957596733322625721548

注：K为各因素在各个水平诱导率总和，k为各因素在各个水平的平均值，R为极差(下同)

Note：K the sum of the various factors in each level，k the average of the factors at each level， R Indicate range (same below)

表4平陆百合鳞片分化率方差分析

Table4 Analysis of scale differentiation rate of lily

变异来源Sourceofvariation平方和Squaresumdf均方AverageF值F⁃valueSig6⁃BA131568134385606598∗∗0025NAA6735332245103380799纳米碳525413317513826350144误差398788666465总计8807128516

注：**表示在0.01水平上差异极显著(下同)

Note：**indicate the obviously significant differences(P<0.01) (same below)

2.2 纳米碳与ZT、IBA配比对平陆百合鳞片分化的影响

将百合鳞片以平铺放置方式接种于以下培养基，分化小鳞茎的数量数及其长势均弱于6-BA、NAA和纳米碳处理组，40 d后统计结果见表5。

由表5可知，不同浓度ZT、IBA与不同浓度纳米碳配比时对百合鳞片分化的影响也不同。在附加相同激素的培养基中，随着纳米碳浓度的升高，鳞片分化率也基本呈现先升后降的趋势；但随着

表5纳米碳与ZT、IBA配比对鳞片分化的影响

Table 5 Effects of nano-carbon and ZT and IBA ratio on scale differentiation

编号Code因素FactorsZT/mg·L-1IBA/mg·L-1纳米碳/mg·L-1分化率/%Differentiationrate1020120048572020140069523020160062864020180052385050220060006050240067617050260074388050280082869080320083811008034008381110803600914312080380076191310042005048141004400609515100460071431610048005714

激素浓度的升高，以配比中浓度的纳米碳促鳞片分化效果更好。所设处理中以处理11分化率最高，为91.43% (图2 c)，但分化出的小鳞茎也出现部分徒长现象，不太健壮；而处理1的促分化效果较差，分化率仅为48.57% (图2d)，但分化出的小鳞茎生长较健壮。极差分析可知(见表6)，ZT、IBA和纳米碳的极值分别是25.48、7.36和14.31，说明ZT对平陆百合鳞片分化的影响最大，纳米碳次之，IBA的作用最小。

图2 纳米碳与ZT、IBA配比对平陆百合鳞片分化的影响Fig.2 Nano-carbon and ZT、IBA ratio of flat lily scales differentiation culture 注：c 培养基：MS+ZT 0.8 mg·L-1+IBA 0.3 mg·L-1+纳米碳600 mg·L-1)；d 培养基:MS+ZT 0.2 mg·L-1+IBA 0.1 mg·L-1+纳米碳200 mg·L-1)Note:c(medium: MS+ZT 0.8 mg·L-1+IBA 0.3 mg·L-1+carbon 600 mg·L-1); d (medium: MS+ZT 0.2 mg·L-1+IBA 0.1 mg·L-1+nano carbon 200 mg·L-1)

运用SPSS软件对百合鳞片分化结果进行方差分析。从主体间效应检验表(表7)可以得出，在Sig=0.05水平上，ZT对平陆百合鳞片的分化具有显著性差异，IBA和纳米碳对鳞片的分化没有显著性差异；F值：ZT>纳米碳>IBA，表明3因素对百合鳞片分化作用的主次关系为ZT>纳米碳>IBA，这与极差分析的结果一致。综合考虑，ZT与IBA配比时诱导鳞片分化的最佳培养基为MS+ZT 0.8 mg·L-1+IBA0.3 mg·L-1+纳米碳600 mg·L-1。

表6平陆百合鳞片分化率极差分析(直观分析)/mg·L-1

Table6 Analysis of scale differentiation rate of lily (visual analysis)

试验因素TestfactorZTIBA纳米碳水平和K1K2K3K4水平均值K1K2K3K4极值R23333264752428628485290482818933524261053001024000277142685758336619607271217262704783816526750360006929671425487361431

表7平陆百合鳞片分化率方差分析

Table7 Analysis of scale differentiation rate of lily

变异来源Sourceofvariation平方和Squaresumdf均方AverageF值F⁃valueSigZT/mg·L-1166911135563709854∗∗0010IBA/mg·L-113326334442107870544纳米碳/mg·L-1435246314508225700150误差338770656462总计7729934616

3 讨论

目前最常用的试验设计和分析方法一般为正交试验设计分析方法，它选取具有代表性的试验点来进行试验，进而达到以典型试验代替全面试验而实现优化[12]。正交设计可减少试验次数和试验分析方法的繁杂，克服培养基设计的盲目性，使各组合均匀搭配，最终迅速找到最优方案，确定影响实验的主次因素[13,14]。本试验分别对两种组合直观分析、方差分析、多重比较，筛选出诱导平陆百合鳞片分化的最适宜培养基为MS+6-BA 0.5 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1+纳米碳800 mg·L-1，确定了影响鳞片分化的主次因素即6-BA>纳米碳>NAA，为优化平陆百合鳞片分化体系提供了依据。

百合鳞片分化能力的大小受多种因素的影响，如百合品种、激素组合、接种鳞片部位(外层、中层、内层)、接种方式(平铺放置、竖直插入)等[15]。植物激素种类和配比调节着鳞片分化率的高低及鳞茎的大小，相同植物的不同外植体或不同植物相同器官对外源植物激素的需求不同[16]。徐丽萍等[17]选用青海细叶百合鳞片作为外植体，获得最适分化培养基为MS+6-BA 0.5 mg·L-1+NAA 0.3 mg·L-1分化率为73.3%。 王刚[18]等报道的百合鳞片诱导分化的最适培养基MS+ 6-BA 0.5～1.0 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1。殷丽娜[19]等选用平陆百合外层鳞片最为外植体，得最适分化培养基为MS+ZT 1.5 mg·L-1+IBA 0.1 mg·L-1分化率90.0%。本研究在6-BA、NAA、纳米碳组合下，经极差分析得到3种因子影响百合鳞片分化的主次关系为6-BA﹥纳米碳>NAA；而ZT、IBA、纳米碳组合下, 经极差分析得到3种因子影响百合鳞片分化的主次关ZT﹥纳米碳>IBA，说明外源植物激素对诱导百合鳞片分化中起决定作用，而纳米碳可以促进激素对鳞片分化的诱导作用。

纳米碳是一种小尺寸纳米材料，具有较强的吸附能力，能够调节植物体内多种酶的活性，改善植物光合性能，提高作物产量，在提高肥料利用率方面也有很好的效果[20,21]，王佳奇等[22]研究发现纳米碳可促进玉米的种子和幼苗萌发及根系生长，促进其对水分及矿质元素的吸收。本试验在最佳培养配方的条件下，附加不同浓度的纳米碳均可促进鳞片的分化，这可能是纳米碳的吸附性有关，促进了百合鳞片对培养基中各种成分的吸收和利用，同时调控激素之间的平衡，其具体的作用机制如何，对植物组织培养的其它途径和过程还有何作用，还需进一步研究。

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Effectsofnano-carbononscaledifferentiationofLiliumbrowniivar.virus-freeplants

WangPengli,RenJianhong,WangXiaolu,WangYuxuan,ZhaoJuan*

(CollegeofAgriculture,ShanxiAgriculturalUniversity,Taigu030801,China)

[Objective]The effects of different concentrations of nano-carbon on the differentiation of Lilium davidii were studied, the aim of this study was to optimize the screening medium and to provide reference for the application of nano-carbon in plant tissue culture.[Methods]The effects of plant hormones and different concentrations of nano-carbon on the differentiation of cultivated flora were studied by orthogonal design.[Result]When 6-BA, NAA and different concentrations of nano-carbon were used, the best medium for scale differentiation was MS+6-BA 0.5 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1+nano-carbon 800 mg·L-1, the differentiation rate of 98.09%; When ZT, IBA and different concentrations of nano-carbon were used, the best medium for scale differentiation was MS+ZT 0.8 mg·L-1+IBA 0.3 mg·L-1+carbon 600 mg·L-1, the differentiation rate of 91.43%.[Conclusion]The addition of different concentrations of nano-carbon in the culture medium could promote the differentiation of lily scales. The effects of different concentrations of nano-carbon on the differentiation of scales were different, and the optimum concentration was 600-800 mg·L-1.

Nano carbon, PingLu lily, Scale differentiation

S682.29

A

1671-8151(2017)12-0879-05

2017-07-21

2017-09-18

王鹏丽(1990-)，女(汉)，山西左权人，硕士研究生，研究方向：植物组织培养

*通信作者：赵娟，博士，副教授，Tel:0354-6286958; E-mail:sxndzhaojuan@163.com

自然基金青年项目(31601369)；山西省面上青年基金(201601D202054)；山西省科技攻关项目(20130311014-1)；山西农业大学博士科研启动项目(2012YJ13)

(编辑：韩志强)