朱诚棋，张蒙，马涛，孙朝晖，李奕震，温秀军

(华南农业大学林学院林学与风景园林学院，广东 广州 510642)

土沉香对黄野螟抗性机理的初步研究

朱诚棋，张蒙，马涛，孙朝晖，李奕震，温秀军

(华南农业大学林学院林学与风景园林学院，广东 广州 510642)

采用紫外分光光度计，分析测定林间筛选的对黄野螟HeortiavitessoidesMoore具有不同抗性表现的土沉香Aquilariasinensis(Lour.) Gilg植株(感虫植株、抗1植株、抗2植株)叶片中可溶性糖、可溶性蛋白质及单宁的含量。结果表明，3种不同抗性的土沉香叶片中可溶性糖含量从大到小依次为：感虫叶片，抗1叶片，抗2叶片；可溶性蛋白含量从大到小依次为:感虫叶片，抗2叶片，抗1叶片；叶片单宁含量从大到小依次为：抗2叶片，抗1叶片，感虫叶片。可溶性糖、可溶性蛋白含量的变化与其抗虫性呈负相关，单宁含量与抗虫性呈正相关。

黄野螟；土沉香；抗虫机理；抗性品种

土沉香Aquilariasinensis(Lour.) Gilg为瑞香科Thymelaeaceae沉香属Aquilaria植物，又名白木香、女儿香、崖香和蜜香等。土沉香在国外主要分布于印度、马来西亚[1]以及亚洲东南部，国内分布于海南、广东、广西、福建、台湾等低纬度地区[2]。土沉香不仅是传统名贵的天然香料[3]，而且是唯一能够生产中药沉香的药用植物[4]，现代医学研究表明，中药沉香味辛、苦，性微温，具有温和止呕，行气止痛，纳气平喘的功效，可用于治疗胸腹、胀闷疼痛，肾虚气逆喘急等疾病[5]。

黄野螟HeortiavitessoidesMoore是土沉香的主要食叶害虫，这种害虫具有突发性、食叶量大、危害期长等特点，严重威胁土沉香产业的发展[6-7]，目前对黄野螟的生物学、生态学特性、化学防治和性信息素的开发应用等方面的研究报道较多[8]，但尚无抗虫土沉香品种选育的报道及土沉香抗虫机制方面的研究。探讨土沉香抗虫机制，有助于揭示黄野螟种群暴发的原因，为新型害虫行为调控剂的开发研究提供依据。

林间调查发现，土沉香种群中普遍存在3种不同抗性的植株，在外部形态和抗虫能力上有显著差异。抗1植株叶片细小，略发黄；抗2植株叶片厚绿，革质化程度高；感虫土沉香叶片细长嫩绿。作者以3种对黄野螟有抗性的土沉香品种为材料，研究土沉香叶片中可溶性糖、蛋白质以及单宁的含量及其与黄野螟抗性的关系，为深入研究土沉香对黄野螟的抗性机制，寻求黄野螟种群监控和无公害防治的有效措施。

1 材料和方法

1.1 试验地概况 试验地位于广州市土沉香种植基地(N23°13′,E113°10′)，海洋性亚热带季风气候，年均气温22 ℃，年平均相对湿度77 %，年降雨量1 720 mm。地貌类型属低、中丘陵，海拔162 m，土壤为花岗岩风化形成的微酸性沙壤土。现有土沉香1万株，间距2 m×2 m，树龄5～8 a，树高2～4 m。

1.2 药剂与仪器 供试药剂为蒽酮试剂，葡萄糖，考马斯亮蓝 G-250 进口分装，牛血清蛋白电泳纯，无水乙醇，磷酸，钨酸钠，磷钼酸，以及无水碳酸钠。

供试仪器为电子天平，电热恒温水浴锅，搅拌器，超声波清洗器，万分之一电子分析天平(GA110型，德国产)以及紫外分光光度计(UV-2201型，日本岛津公司)。

1.3 试验方法

1.3.1 试验叶片采集 土沉香叶采集于2014年10月黄野螟危害盛期。调查发现基地中有3种不同抗性的土沉香植株：抗虫1、抗虫2、感虫。抗虫1是具有明显抗虫性的植株，位于叶片几乎全被吃光的土沉香林内，周围约30 m范围内上百株土沉香叶片全部被食光，该株叶片完好，尽管在其叶片上发现十多块卵块，但叶片几乎没有被危害。抗虫2位于遭受严重危害的土沉香林缘，其周围土沉香叶片被害率均在80%以上，但该植株叶色墨绿，既没有发现黄野螟卵块也没有发现幼虫危害症状，叶片完好率在95%以上。

采样时，分别在3种土沉香树冠的东、西、南、北、中5个方位的当年生枝条上采取一定数量的健康叶片(图1)，组成混合样。将采集来的叶片用清水冲洗干净并晾干。

A：抗虫叶片1；B：抗虫叶片2；C：感虫叶片图1 三种不同的土沉香叶片

1.3.2 叶片含糖量测定

1.3.2.1 叶片可溶性糖提取 分别称取3种土沉香新鲜叶片1.5 g，置于研钵中，加入少量蒸馏水，仔细研磨成匀浆，转入50 mL试管中，放入沸水浴中煮沸30 min，取出冷却，5000 r/min离心10 min，收集上清液于另一50 mL试管中，残渣用2 mL蒸馏水重复洗2次，合并上清液。在上清液中加0.5 g活性炭，80 ℃水浴脱色30 min，过滤后称重，取5 mL滤液定容50 mL待测，每种叶片设置3个重复。

1.3.2.2 标准曲线绘制 分别精密量取葡萄糖标准液(0.1 mg/mL)0，0.2，0.4，0.6，0.8，1 mL于具塞试管中，并用蒸馏水补至1.0 mL，将试管放入冷水浴中，分别加入蒽酮试剂4 mL，摇匀。置于沸水浴中加热15 min，冷水中冷却至室温。20 min后，以空白作对照，用1 cm比色皿，在分光光度计上，620 nm波长处测定吸收度。以吸收度A标为纵坐标，浓度C标为横坐标，绘制标准曲线。

1.3.2.3 样品含量测定 吸取 0.1 mL样液于试管，蒸馏水补足至1 mL，将试管置于冰水浴中，加入4 mL蒽酮试剂并摇匀，在沸水浴中煮沸15 min，取出冷却，在分光光度计620 nm波长处比色，依据标准曲线法，以葡萄糖溶液(0.1 mg/mL)为标准液绘制标准曲线，求出各样品的可溶性糖的含量。所测样品均设3个重复，取其平均值报告。相对误差 ≤ 5 %。样品中可溶性糖含量计算公式为：

S(mg/g)=(C样×V×103)/(106×M)×100 %

式中：S为可溶性糖含量，C样为提取液的含糖量(μg/mL)，代入吸光值A样由标准曲线计算可得；V是供试液的定容量(mL)，M是样品鲜重(g)。

1.3.3 叶片蛋白质含量测定 蛋白质含量的测定采用考马斯亮蓝G-250染色法，考马斯亮蓝染料在稀酸溶液中与蛋白质结合后变成蓝色，最大光吸收在 595 nm，且蓝色的深浅与溶液中的蛋白质含量成正比。

1.3.3.1 叶片蛋白质提取 称取3种具有不同抗虫性的土沉香新鲜叶片各 0.5 g放入研钵中，加入5 mL蒸馏水，研磨成匀浆，移到离心管4000 r/min离心20 min，过滤上清液并定容到5 mL。

1.3.3.2 标准曲线的绘制 精密量取牛血清蛋白标准液(100 μg/mL)0.0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mL，置于具塞试管中，并用蒸馏水补充至1.0 mL，加入5 mL考马斯亮蓝G-250，摇匀，25 ℃水浴放置5 min后，以空白作对照，用1 cm比色皿，在分光光度计595 nm下比色测定吸光度。以吸收度A标为纵坐标，浓度C标为横坐标，绘制标准曲线。

1.3.3.3 样品含量测定 取3种具有不同抗虫性的土沉香样品0.1 mL上清液，向各管中加入5 mL考马斯亮蓝 G-250溶液摇匀，25 ℃水浴放置5 min后，在分光光度计595 nm下比色测定吸光度。依据标准曲线法，以牛血清蛋白溶液(100 μg/mL)为标准液绘制标准曲线，求出各样品可溶性蛋白的含量。所测样品均设3个重复。样品中蛋白质含量计算公式为：

P(mg/g)= (C标×V1)/(1000×Vt×FW)

式中：P为样品中蛋白质含量，C标为查标准曲线值(μg)，Vt是提取液总体积(mL)，FW是样品鲜重(g)，Vt是测定时加样量(mL)。

1.3.4 叶片单宁含量测定 叶片中的单宁在碱性溶液中会将磷钨钼酸还原，生成蓝色化合物，其颜色深浅与单宁含量成正比，与标准溶液作对比可以测得叶片中的单宁含量。

1.3.4.1 叶片单宁提取 将3种具有不同抗虫性的土沉香新鲜叶片去杂洗净后，置于恒温干燥箱中，120 ℃杀青20 min，60 ℃烘干，捣碎过60目筛，称取5 g土沉香叶粉末放入250 mL锥形瓶中，加塞密封，用体积分数80 %的乙醇置于恒温水浴锅中加热回流，浸提3次，每次2 h，双层滤纸过滤，并定容于250 mL容量瓶内。准确吸取0.5 mL待测液于100 mL容量瓶中，用体积分数80 %的乙醇定容至100 mL。

1.3.4.2 标准曲线的绘制 精密量取单宁标准液(0.102 mg/mL)0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mL滴入6只盛有约10 mL蒸馏水的25 mL容量瓶中，分别加入3.0 mL Folin-Denis显色剂、5 mL饱和Na2CO3溶液，加入蒸馏水定容至25 mL，摇匀避光显色30 min后，以未加单宁试剂的混合液作空白，测定760 nm波长处吸光度值。以吸光度值作纵坐标，以溶液中单宁的含量(mg)作横坐标，绘制标准曲线。

1.3.4.3 样品测定 取0.5 mL土沉香叶单宁提取液放入盛有约10 mL蒸馏水的25 mL容量瓶中，加入3.0 mL显色剂并摇匀，加入5 mL饱和Na2CO3溶液，用蒸馏水定容至25 mL，充分摇匀静置避光显色30 min后，以空白试剂作参比，1 cm比色皿在760 nm波长处测吸光度。样品单宁含量计算公式：

T(%)=(A×V1×d)/(m×103)×100 %。

式中:T为单宁含量，A是由测得的吸光度值在标准曲线上查出溶液中的单宁含量(mg)；V1是样品提取液定容体积(mL)；d是稀释倍数；m是样品质量(g)。

1.3.5 数据分析 采用Microsoft Excel 2013软件对数据进行处理和制图，所有数据均采用SPSS 22软件进行数据处理，Duncan氏新复极差法进行差异显著性检验。

2 结果与分析

2.1 叶片可溶性糖含量 葡萄糖含量在0～100 μg/mL范围内，葡萄糖含量与吸光度值有较好的线性关系，回归方程y=0.0075x+0.0104，相关系数为R2=0.999。

在3种不同抗虫性的土沉香样品中，感虫土沉香叶片可溶性糖含量为2.7 mg/g，占样品鲜重的0.27 %，抗1土沉香叶片可溶性糖含量为1.5～2.1 mg/g，占样品鲜重的0.18 %，而抗2土沉香叶片可溶性含量最低，为1.1～1.5 mg/g，占样品鲜重的0.13 %(图2)。抗性土沉香叶片可溶性糖含量远远低于感虫土沉香叶片可溶性糖含量(P<0.01)，其中感虫叶片的可溶性糖含量为抗1的1.5倍，抗2的2.1倍。虽然抗1的可溶性糖含量比抗2的含量多，但未达到显著性差异(P<0.05)。

2.2 叶片蛋白质含量 牛血清蛋白含量在0～80 μg/mL范围内，蛋白质含量与吸光度值有较好的线性关系，回归方程y=0.004 9x+0.008，相关系数为R2=0.998 9。

抗虫品种与感虫品种可溶性蛋白质含量差异显著(P<0.05)，其中感虫土沉香叶片可溶性蛋白含量为6.47～7.29 mg/g，抗1土沉香叶片可溶性蛋白含量为4.69～5.23 mg/g，是感虫土沉香叶片可溶性蛋白含量的72 %左右(图3)。而抗2土沉香叶片可溶性蛋白的含量为5.12～5.48 mg/g，约为感虫土沉香叶片可溶性蛋白含量77 %，可溶性蛋白含量由大到小依次为：感虫土沉香叶片，抗2土沉香叶片，抗1土沉香叶片。抗1、抗2土沉香叶片可溶性蛋白含量差异不显著(P<0.05)，但可溶性蛋白含量和抗虫性呈负相关，即抗性越强，可溶性蛋白含量越低。

注：图中数据用平均值±标准误表示，柱形图上方不同小写字母表示差异显著(P<0.05)；相同小写字母表示差异不显著(P>0.05)。

图2不同抗性土沉香叶片可溶性糖含量

注：图中数据用平均值±标准误表示，柱形图上方不同小写字母表示差异显著(P<0.05)；相同小写字母表示差异不显著(P>0.05)。

图3不同抗性土沉香叶片可溶性蛋白质含量

2.3 叶片单宁含量 单宁含量在0～0.012 mg/mL范围内，单宁含量与吸光度值有较好的线性关系，回归方程y=35.378x+0.006 4，相关系数为R2=0.998 9。

分析结果表明，感虫土沉香叶片样品中的单宁含量为(9.13±0.49)%，抗1的单宁含量为(11.89±0.31)%，抗2的单宁含量为(14.01±0.47)%。三者之间差异性极显著(P<0.01)。抗性土沉香叶片单宁含量显著高于感虫土沉香叶片，而2种抗性土沉香中，抗2品种大于抗1品种(图4)。

3 结论与讨论

实验室内测定结果显示，抗1植株和抗2植株叶片可溶性糖和可溶性蛋白质的含量均显著低于感虫植株叶片(P<0.05)，但两者抗性植株叶片单宁含量均高于感虫植株(P<0.05)。

注：图中数据用平均值±标准误表示，柱形图上方不同小写字母表示差异显著(P<0.05)；相同小写字母表示差异不显著(P>0.05)。

图4不同抗性土沉香叶片单宁含量

可溶性糖含量与植物的抗虫性相关，且在抗虫种与感虫种间差异显著。然而植物的抗虫性是植物内在和外在理化特性的综合表现，是一个复杂的防御能力的综合体现[9-11]，因此对于抗性土沉香树种抗性机制有待进一步确定。

抗性土沉香叶片内可溶性糖及可溶性蛋白的含量较低。寄主植物只有在满足一定的营养成分和含量后，才能被某些植食性昆虫危害。由此可推断，黄野螟不取食抗性土沉香叶片可能与寄主植物营养物含量未满足其需求有关。

黄野螟对土沉香的选择性受植株体内各种抗生物质的综合影响，并不是某单一物质的作用[12]。本试验仅研究了土沉香叶片中单宁含量及其与黄野螟抗性的关系，而叶片内其他次生物含量及其与黄野螟抗性的关系有待进一步研究。

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ResistancemachenismofAquilariasinensisagainstHeortiavitessoidesMoore

ZHU Chengqi,et al.

(College of Forestry and Landscape Architecture,South China Agricultural University,Guangzhou 510642,China)

The content of soluble sugar,soluble protein and tennin from the leaves ofAquilariasinensis(Lour.) Gilg were measured by ultraviolet spectrophotometer.These leaves showed different resistance towardsHeortiavitessoidesMoore.The content of soluble sugar and soluble protein in resistant leaves were significantly lower than susceptible leaves.However,the content of tannin in resistant leaves was obviously higher than susceptible ones (resistant trees 2> resistant trees 1> susceptible trees).The content of soluble sugar and soluble protein had negative correlations with the resistance,while the content of tannin had positive correlations with the resistance.

HeortiavitessoidesMoore;Aquilariasinensis;insect-resistant mechanism;resistant varieties

2017-01-11；

2017-02-13

广东省林业科技创新项目 黄野螟性信息素鉴定与抗虫品种选育(2011KJCX028、2014KJCX020-01)

朱诚棋(1992—)男，浙江嘉兴人，硕士研究生，主要研究方向：森林害虫防治及昆虫性信息素研究。E-mail:cqzhu@stu.scau.edu.cn

温秀军，教授，主要从事森林保护研究，E-mail:wenxiujun@scau.edu.cn。

S763.42

A

1671-0886(2017)05-0005-04

(责任编辑 王巧申)