路广亮，徐颖,2，罗卿权，王章训，李丽，蔡丹群

(1.上海市园林科学规划研究院，上海 200232； 2.上海城市困难立地绿化工程技术研究中心，上海 200232； 3.上海辰山植物园，上海 201602；4.东郊宾馆，上海 201203)

草坪害虫淡剑灰翅夜蛾高致病力莱氏野村菌菌株的筛选及其田间防治效果

路广亮1，徐颖1,2，罗卿权1，王章训1，李丽3，蔡丹群4

(1.上海市园林科学规划研究院，上海 200232； 2.上海城市困难立地绿化工程技术研究中心，上海 200232； 3.上海辰山植物园，上海 201602；4.东郊宾馆，上海 201203)

室内测定了7株莱氏野村菌Metarhiziumrileyi菌株对草坪害虫淡剑灰翅夜蛾Spodopteradepravata3龄幼虫的毒力，结果表明，25 ℃下1×108个/mL孢子浓度莱氏野村菌对淡剑灰翅夜蛾的致死中时LT50为3.75 ～ 5.21 d。选取室内毒力测定中效果较好的菌株DT2011N7分别在8月和9月进行2次野外药效试验，结果表明，在8月高温条件下，莱氏野村菌对淡剑灰翅夜蛾无防治效果，而9月份防治效果明显，药后7 d，1×108个/mL和1×107个/mL孢子悬浮液的校正防效分别为78.53%和54.29%，药后10 d达到最佳防效，分别为79.33%和89.85%，药后20 d，仍有一定的防效，分别为46.17%和41.55%。试验表明莱氏野村菌对淡剑灰翅夜蛾具有良好的杀虫活性和持效性，具有作为生防菌株开发利用的潜力。

莱氏野村菌；淡剑灰翅夜蛾；致死中时；防治效果

淡剑灰翅夜蛾Spodopteradepravata(原名淡剑袭夜蛾Sidemiadepravata)是近年来危害多种禾本科草坪草的重要害虫，在日本、韩国也有分布[1-2]。在我国，该虫被报道在上海、江苏、湖北、湖南、浙江、福建、河北、辽宁、安徽、天津和山东等地对草坪造成严重危害[3-9]，虫口密度高时，每平方米可达数百头，对草坪造成毁灭性危害，是我国东部地区最为严重的草坪害虫。同时，由于因其产卵量大、世代重叠严重[7]，防治难度较大。目前对该虫的防控多依靠有机磷农药，对人体健康和环境危害较大，并不适宜在人们休闲休憩的草坪上使用，因此探寻安全高效的生物防治技术的重要性日益凸显。

利用昆虫病原真菌防治害虫是有害生物防治的重要手段之一[10]，与传统化学防治相比具有以下优势：对非靶标生物(包括人)及环境安全，能形成昆虫病害流行，不易产生抗药性[11]。因此，真菌杀虫剂的研究开发受到了广泛的关注和重视。以绿僵菌产品为例，截至2014年7月，全球有83个获得注册，防治对象分别属于12个目33个科[12]。

Metarhiziumrileyi原名莱氏野村菌Nomuraearileyi[13]，2014年Kepler 等重新界定了其分类地位，将其归于绿僵菌属Metarhizium[14]。该菌对防治鳞翅目幼虫极具潜力，其在一定环境条件下，能造成病害流行，有效降低害虫种群数量[15-16]，已被广泛报道可侵染夜蛾科害虫，对斜纹夜蛾Spodopteralitura、棉铃虫Helicoverpaarmigera、甜菜夜蛾Spodopteraexigua等鳞翅目害虫有较强的致病力[16-17]。但迄今为止，未见包括莱氏野村菌在内的昆虫病原真菌防治草坪害虫淡剑灰翅夜蛾的报道。

经调查发现，上海局部地区草坪上淡剑灰翅夜蛾和斜纹夜蛾有受真菌侵染大量死亡的现象，结合形态学特征和多基因序列分析明确其病原真菌为Metarhiziumrileyi[18]。在此基础上，作者筛选出对淡剑灰翅夜蛾幼虫高致病力菌株进行田间防治试验，为莱氏野村菌对该虫的防治应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料 供试菌株：莱氏野村菌菌株均为本实验室分离并保存的菌株，分离自罹病淡剑灰翅夜蛾或斜纹夜蛾幼虫。

供试昆虫：野外采集淡剑灰翅夜蛾虫卵，自然孵化后，将幼虫转移至养虫盒，置于光照培养箱中，光周期 14L∶10D，湿度75%，温度25 ℃，以禾本科草坪草为饲料人工饲养，至成虫羽化后交尾产卵，取下一代3 龄幼虫作为供试虫。

培养基：马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)：去皮马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂粉16 g，加水定容至1 000 mL；萨氏麦芽糖酵母培养基(SMAY)：麦芽糖提取物40 g、蛋白胨10 g、酵母粉10 g、琼脂粉16 g，加水定容至1 000 mL。

1.2 室内毒力测定 在SMAY固体培养基上活化供试菌株后，涂板接种至SMAY 平板，于26 ℃下全光照恒温培养10 ～ 15 d，待孢子长满平板后，用0.05% Tween-80洗脱孢子并转移至灭菌三角瓶中，在涡旋震荡仪上震荡1 min，超声波清洗仪上处理5 min后，用100目筛网过滤并收集滤液，用血球计数板计数滤液中孢子数，用0.05% Tween-80将孢子滤液稀释为1×108个/mL。

采用浸渍法接种淡剑灰翅夜蛾3 龄幼虫，每处理80头。试虫放入新鲜制备的1×108个/mL的孢子悬浮液中浸蘸10 s后，置于无菌滤纸上，任其爬行晾干水分，移入灭菌养虫盒，每盒1虫。用0.05% Tween-80处理对照试虫。将上述试虫置于光周期L14∶D10，温度25 ℃，湿度75%的培养箱培养。每天观察记录死亡情况，计算校正死亡率。使用统计软件SAS 8.1计算致死中时LT50。

1.3 野外防治试验 莱氏野村菌DT2011N7于SMAY固体培养基上26 ℃全光照恒温培养10～15 d，用0.05% Tween-80洗脱孢子，制备浓度为1×108个/mL的孢子悬浮液，用此孢子悬浮液10倍稀释制备1×107个/mL的孢子悬浮液。对照供试药剂为48%毒死蜱乳油(陶氏益农)。

野外试验分别于2016年8月和9月在上海辰山植物园不同地块矮生百慕达草坪上进行。每次试验设3个处理，莱氏野村菌孢子悬浮液1×108个/mL和1×107个/mL，对照药剂48%毒死蜱乳油稀释1000倍，喷施清水作为空白对照。每处理3个重复，每个小区20 m2，小区内9点棋盘式取样，每样方20 cm×20 cm，计数样方内的活虫数量。施药前调查各处理小区内虫口基数，药后3，7，10，20 d分别调查小区内活虫数，计算各处理的虫口减退率及校正防效。试验期间上海地区的气象状况见表1。应用Excel 2007计算虫口减退率及校正防效，使用SAS 8.1软件进行单因素方差分析。

表1 2016年试验期间上海地区主要气象指标

2 结果与分析

2.1 室内高毒力菌株筛选结果 7株莱氏野村菌均在接种后2 d开始导致淡剑灰翅夜蛾3龄幼虫死亡，在接种后7～8 d致试虫全部死亡。受莱氏野村菌侵染死亡的虫体僵直，死亡后2～3 d虫体表面布满白色菌丝，4～5 d虫体表面开始出现淡绿色粉状物，5～7 d虫体表面布满淡绿色粉状物，为莱氏野村菌的分生孢子(图1a)。表2结果表明，7株莱氏野村菌菌株接种淡剑灰翅夜蛾后，均在4～5 d达到对试虫50 %的致死率，其中DT2014-2、XW-DSN3、DT2011N7的致死中时较短，分别为3.75，3.83，4.14 d，表明这3株菌株对淡剑灰翅夜蛾具有较强的致病力。

a.室内毒力试验中死亡的幼虫虫体；b.施用莱氏野村菌10 d后田间幼虫死亡虫体图1 受莱氏野村菌侵染死亡的淡剑灰翅夜蛾幼虫虫体

表2 莱氏野村菌不同菌株对淡剑灰翅夜蛾3龄幼虫的致死中时(LT50)

2.2 野外防治效果 8月高温条件下，喷施莱氏野村菌DT2011N7孢子悬浮液后，淡剑灰翅夜蛾3，7，10 d后的虫口密度虽然均有所减退，但由于对照区的自然虫口减退率也较快，莱氏野村菌的校正防效均为负值。野外死亡虫体干瘪僵硬，颜色变为黑色，散落于地面，未见表现受莱氏野村菌侵染症状的死亡虫体。表明在此次试验中，莱氏野村菌对淡剑灰翅夜蛾未显示防效。对照化学药剂48 %毒死蜱乳油1 000倍液的校正防效良好，为99.81%～100%(表3)。

表3 2016年8月16日野外防治试验结果

注：表中数据为3个重复的平均值，同列不同大写字母代表不同处理间有极显著性差异(Plt;0.01)。

9月适温条件下，喷施莱氏野村菌DT2011N7孢子悬浮液后，药后3 d无效果，药后7 d开始表现出明显的防治效果，1×108个/mL和1×107个/mL孢子悬浮液的校正防效分别为78.53%和54.29%，高浓度孢子悬浮液的效果明显高于低浓度。药后10 d达到最佳防效，1×108个/mL和1×107个/mL孢子悬浮液的校正防效分别达到79.33%和89.85%。药后20 d仍有一定防效，1×108个/mL和1×107个/mL孢子悬浮液的校正防效分别为46.17 %和41.55 %。对照化学药剂48 %毒死蜱乳油1 000倍液的校正防效为95.74 %～100 %(表4，5)。

注：表中数据为3个重复的平均值，同列不同大写字母代表不同处理间有极显著性差异(Plt;0.01)。

表5 2016年9月9日野外防治试验校正防效

注：表中数据为3个重复的平均值，同列不同大写字母代表不同处理间有极显著性差异(Plt;0.01)。

药后7,10,20 d田间喷施莱氏野村菌孢子悬浮液的区域可见较多受莱氏野村菌侵染的淡剑灰翅夜蛾幼虫死亡虫体，初期虫体表面密布白色菌丝(图1b)，后期由于表面着生淡绿色分生孢子，整个虫体转为淡绿色或绿色，且死亡虫体大多附于草茎或草叶上，只有少数散落在地面上。而清水对照区及化学药剂处理区药后20 d均未见受侵染死亡虫体。药后50 d检查时，在清水对照区、化学药剂处理区及园内其它草坪上均可见到由于病害自然流行受侵染死亡的淡剑灰翅夜蛾罹病虫体。

3 结论与讨论

致病力是衡量菌株生防潜力的重要指标[19]。由于虫生真菌具有一定的遗传多样性，不同寄主来源的同种菌株对不同昆虫的毒力差别较大[20]，即使是分离自同一种寄主昆虫的不同菌株毒力也有差异[19]。因此分离并筛选对淡剑灰翅夜蛾高毒力的莱氏野村菌菌株对其生物防治十分重要。本研究选取了分离自两种不同寄主淡剑灰翅夜蛾和斜纹夜蛾的莱氏野村菌菌株进行对淡剑灰翅夜蛾的室内毒力筛选，毒力较高的3株菌株中既有分离自淡剑灰翅夜蛾的菌株，也有分离自斜纹夜蛾的菌株，表明来自这两种寄主的莱氏野村菌不同菌株均可侵染淡剑灰翅夜蛾，且毒力水平相差不大。

气候因素对莱氏野村菌的防治效果影响极大。在8月和9月2次野外防治试验中莱氏野村菌对淡剑灰翅夜蛾的防治效果完全不同，8月莱氏野村菌对淡剑灰翅夜蛾无防治效果，而9月防治效果明显，药后10 d达到最好防治效果89.8%。8月试验期间白天最高温度的平均值为34.9 ℃，夜间最低温度的平均值为27.1 ℃。9月试验期间白天最高温度的平均值为27.7 ℃，夜间最低温度的平均值为21.6 ℃。温度对莱氏野村菌毒力的直接影响未见报道，但研究表明莱氏野村菌菌株毒力与产孢量及孢子萌发速率具正相关性[20]。同时多位研究者报道温度对莱氏野村菌菌丝生长、产孢及孢子萌发的影响[15,21-22]，20～ 30 ℃之间莱氏野村菌可以较好生长，32 ℃以上菌丝生长、产孢及孢子萌发明显受到抑制，其中涂增 等[15]和孔琼 等[22]的研究表明，32 ℃时莱氏野村菌基本不产孢。因此推测温度因素影响了施用后莱氏野村菌在田间的生长和繁殖，导致了田间8月和9月防治效果完全不同。

作者观察了淡剑灰翅夜蛾在不同温度下的年龄-龄期生命表，表明在26～30 ℃ 温度下淡剑灰翅夜蛾种群增殖能力最强[23]，这个温度范围恰好介于莱氏野村菌可以较好生长繁殖的温度范围内(20～30 ℃)，因此从适生温度来看，可以利用莱氏野村菌在淡剑灰翅夜蛾发生高峰期对其进行防治。

淡剑灰翅夜蛾在上海的发生高峰为7—10月，自然情况下，野外在10月下旬起才易于观察到淡剑灰翅夜蛾被莱氏野村菌侵染寄生现象，这可能是由于莱氏野村菌大范围流行需要达到一定菌量积累。本研究结果表明9月施用莱氏野村菌对淡剑灰翅夜蛾有较好防效，较田间昆虫病害流行的时间要早，因此可以在9—10月施用莱氏野村菌替代化学药剂防治淡剑灰翅夜蛾，人工施用生防菌缩减了菌量积累所需的时间，使田间大范围寄生提前发生。Sprenkel amp; Brooks[24]和Ignoffo 等[25]早期在研究莱氏野村菌防治大豆田夜蛾科害虫时也指出，施用莱氏野村菌可诱使田间昆虫的真菌病害提前流行，更好地达到在高峰期防治害虫的目的。

施用莱氏野村菌不同浓度孢子在防治初期效果差异明显，在防治后期无正相关差异。药后7 d，1×108个/mL和1×107个/mL孢子悬浮液的校正防效分别为78.53 %和54.29 %，高浓度孢子悬浮液的效果明显好于低浓度，但在药后10 d达到最好防效时，1×108个/mL和1×107个/mL孢子悬浮液的校正防效分别为79.33 %和89.85 %，高浓度孢子悬浮液的效果并没有高于低浓度。施药20 d后1×108个/mL和1×107个/mL孢子悬浮液的校正防效分别为46.17 %和41.55 %，无显著差异。因此，在实际防治应用时，如需达到速效性，可使用较高浓度的莱氏野村菌，如虫口密度较低，对速效性要求不高，推荐使用较低浓度。

本研究结果表明供试莱氏野村菌对淡剑灰翅夜蛾具有良好的杀虫活性和持效性，具有很好的开发利用潜力。但其产孢条件、室内生物学特性等还需进一步研究，以便为其应用提供更多的理论依据。

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(责任编辑 王巧申)

ScreeningandfieldcontrolefficacyofhighvirulentstrainsofMetarhiziumrileyiagainstlawnpestSpodopteradepravata/

LU Guangliang,et al.
(Shanghai Academy of Landscape Architecture Science and Planning,Shanghai 200232 China)

The virulence of sevenMetarhiziumrileyistrains against 3rd instar larvaeSpodopteradepravatawas screened.The bioassay result showed the median lethal time LT50ofM.rileyiagainstS.depravatawas 3.75 ～ 5.21 d with 1×108conidia/mL under 25 ℃.Field trial was conducted to evaluate the efficacy of the selectedM.rileyistrain DT2011N7 in August and September,respectively.While the treatment under higher temperature showed no efficacy in August,the corrected control efficacy in cooler September was 78.53% with 1×108conidia/mL spore suspension and 54.29% with 1×107conidia /mL on the 7th day after treatment,the efficacy on the 10th day was 79.33% and 89.85% respectively,which showed the best control efficacy,and the efficacy in the 20th day was 46.17% and 41.55%,respectively.HenceM.rileyiis a promising fungal insecticide for controllingS.depravata.

Metarhiziumrileyi;Spodopteradepravata;median lethal time (LT50);control efficacy

2017-04-06；

2017-07-03

上海市科技人才计划项目(14YF1414100)，上海市绿化和市容管理局攻关项目辰山科研专项(G142437)

路广亮(1988—)，河南鹤壁人，助理工程师，研究方向为绿化植物病虫害综合治理，E-mail：mn8875@163.com

徐颖，博士，E-mail：xuying20002@163.com。

S763.306.4

B

1671-0886(2017)06-0040-05