温利娟，李 娅，薛晓鸥

（ 北京中医药大学东直门医院，北京 100700）

紫柏凝胶抑制宫颈癌Siha细胞增殖和诱导凋亡的实验研究

温利娟，李 娅，薛晓鸥*

（ 北京中医药大学东直门医院，北京 100700）

目的 研究紫柏凝胶对HPV阳性宫颈癌细胞Siha的增殖抑制和凋亡诱导作用。方法 选取对数生长期Siha细胞，采用不同浓度（15、7.5、3.25 mg/mL）组，不加药物Siha细胞为对照组。MTS检测细胞生长抑制，台盼蓝染色检测细胞 存活率， HOECHST 33342/PI染色法检测凋亡细胞形态学改变。 结果 MTS法检测，各组紫柏凝胶对Siha细胞的生长均有不同程度的抑制作用，3.125 mg/mL剂量组与空白组相比有统计学意义（p＜0.05），IC50为（15±2.1） mg/mL；台盼蓝染色，紫柏凝胶对Siha细胞生长有一定抑制作用，各浓度组细胞生长抑制率均高于对照组（p＜0.05）；紫柏凝胶作用Siha细胞后细胞间质变松，细胞质颗粒增多，染色质凝聚，分块，胞质浓缩； HOECHST 33342/PI染色，荧光显微镜下观察到紫柏凝胶引起细胞发生凋亡。结论 紫柏凝胶能抑制宫颈癌Siha细胞的增殖和诱导其凋亡。

紫柏凝胶；Siha；细胞增殖；细胞凋亡；MTS

紫柏凝胶主要由紫草、黄柏、莪术、金银花、苦参、 百部、白及等药物组成。全方具有清热祛湿、解毒活血、杀虫止痒、敛疮生肌之功。药物治疗后热得退、湿得除、瘀得化、毒得清，自然带下自止，流血自止，创面收敛愈合，阴痒腹痛等诸症缓解。该方由我院名老中医郭志强教授，运用中医“治病当治未病”的理论精髓创立，该方经过前期部分临床观察，用于治疗宫颈高危型HPV（HR-HPV）感染，疗效甚佳[1-10]，但该方的具体作用机理尚不十分明确，值得运用现代化手段去深入研究。本实验通过MTS、细胞形态观察、台盼蓝染色及Hoechst 33342染色，观察紫柏凝胶对HPV阳性宫颈癌Siha细胞增殖和凋亡诱导作用，为抗 HPV感染进而预防宫颈癌的药物研发提供研究基础。

1 材料

1.1 药材与试剂 紫柏凝胶由本实验室萃取（莪术加8倍量水浸泡后水蒸气蒸馏提取，挥发油与冰片用β-环糊精包合，莪术药渣与金银花、白及加8倍量水煎煮2次，过滤，滤液减压浓缩至相对密度为1.10～1.15清膏。紫草、黄柏、苦参、百部、儿茶等5味药加入80%乙醇回流提取2次，提取液，过滤，滤液浓缩至相对密度为1.10～1.15（60～65 ℃）清膏。合并所有上述清膏，喷雾干燥，得干膏粉。

1.2 细胞株与试剂 人宫颈癌细胞Siha购自（上海复祥生物科技有限公司）；DMEM购自（gibco公司）；胰酶购自（gibco公司）；双抗购自（gibco公司）；胎牛血清购自（ExCell Bio公司）；MTS购自（Promega），Hoechst 33342/PI（碧天云）。

1.3 仪器 酶标仪（Thermo公司）；细胞培养箱（Thermo公司）；倒置显微镜（Nikon）；生物洁净使用超净台（Opti MAIR）；低速离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司）。

2 方法

2.1 药液的配置 本实验分为3个不同浓度的紫柏凝胶组，空白组，共4组。分别用精密移液器将紫柏凝胶提取液，用DMEM培养液稀释25、12.5、6.25、3.125、1.562 5、0.781 25、0.406 25 mg/mL，空白组不用药。

2.2 细胞生长抑制实验 采用MTS法检测。选取对数生长期的HPV阳性宫颈癌Siha细胞，调整其细胞浓度为1×105个/mL，每孔100 μL，分别接种于96孔板中培养。培养24 h后加入不同浓度的紫柏凝胶提取液，以不加药物孔为对照组，继续培养24、48、72 h。检测前，用1 mL移液枪将含药培养液吸出，1 mLPBS液洗2次，后加入MTS:DMEM = 1:4混合液1 mL，继续将细胞放置37 ℃培养箱中孵育2 h。用酶标仪测定每孔的吸光度（A），检测波长为570 nm。抑制率（%）=（1 － 药液组 /空白组）×100%[11]。

2.3 对细胞形态的影响 选取对数生长期的HPV 阳性宫颈癌Siha细胞，调整期细胞浓度为3 ×105个/mL，每孔200 μL，分别接种于6孔板中。培养24 h后分别加不同浓度的紫柏凝胶药液，每孔200 μL继续培养。分别于加药后24 h用光学显微镜进行观察。

2.4 台盼蓝检测细胞存活率 Siha细胞贴壁生长于60 mm培养皿中，用高、中、低浓度紫柏凝胶作用于Siha细胞24 h，并设立空白对照组，空白对照组不用药。用精密移液器将细胞培养液及药物吸出，PBSmL洗细胞2次，用含25% EDTA胰酶消化Siha细胞，把收集的细胞放在15 mL离心管中 以1 000 r/min离心5 min，弃上清，用1 mL细胞重悬液重新悬起细胞。吸取100 μL重悬的细胞到0.6 mL EP管内，加入100 μL1%台盼蓝染色液（2×），轻轻混匀，染色3 min。 吸取少量经过染色的细胞，用红细胞计数板计数。数出蓝色细胞和细胞总数。细胞存活率=（细胞总数－蓝色细胞数）/细胞总数×100%[11]。

2.5 Hoechst 33342双荧光染色法观察凋亡细胞的形态表现 Hoechst 33342/PI 双 染 检 测 细 胞 凋 亡，活细胞不发荧光或发弱蓝色荧光；早期凋亡细胞发出较明亮的蓝色荧光；晚期凋亡细胞及死亡细胞发明亮的蓝色荧光及红色荧光[12-17]。高、中、低浓度（浓度分别为15、7.5 、3.25 mg/mL）紫柏凝胶分别作用于HPV 阳性宫颈癌Siha细胞24 h后，离心收集并稀释为细胞悬液5×104，加入 Hoechst33342 0.5 mL，PI 0.5 mL，4 ℃继续孵育30 min，制作临时装片，置于荧光显微镜下观察。

3 结果

3.1 细胞生长抑制实验 见表1。

由表1所示，不同浓度紫柏凝胶对HPV阳性宫颈癌Siha细胞的生长均有不同程度的抑制作用，3.125 mg/mL剂量组与空白组相比均有显著差异（P＜0.05），并呈剂量依赖关；各个浓度组对细胞的抑制率为紫柏凝胶作用时间48 h是最高，并计算紫柏凝胶作用于宫颈癌Siha细胞IC50为（15±2.1） mg/mL。

3.2 对细胞形态的影响 倒置显微镜下观察，空白对照组Siha细胞贴壁生长，细胞伸张，扁平状，细胞质均匀透明，细胞核内一般有1～ 4个核仁，细胞核及细胞膜轮廓明显，细胞间结构连接紧密，生长旺盛。而紫柏凝胶高中低3个浓度组作用后，细胞间质变松，细胞质颗粒增多，染色质凝聚，分块，胞质浓缩（见图1）。

3.3 各组细胞存活率比较 台盼蓝染色结果，对照组细胞透明无染色，死亡细胞呈蓝染，各组浓度紫柏凝胶对Siha细胞生长均有一定影响，见表2。

3.4 Hoechst 33342/PI染色观察凋亡细胞形态 经过Hoechst 33342/PI染色后，荧光显微镜下见凋亡细胞形态不规则，早期凋亡细胞发出较明亮的蓝色荧光，部分凋亡细胞碎裂呈点状，大小不一，出现明显的凋亡细胞形态。见图2。

表2 高中低浓度作用于Siha细胞存活率（x± s ）

图2 Hoechst 33342/PI染色观察凋亡细胞形态

4 讨论

本实验通过台盼蓝和MTS实验观察紫柏凝胶对HPV阳性宫颈癌细胞增殖的抑制作用，得到其IC50为（15±2.1）mg/mL，提示紫柏凝胶对宫颈癌Siha细胞具有杀伤作用。宫颈癌Siha细胞经过15、7.5、3.25 mg/mL浓度紫柏凝胶作用后，经Hoechst 33342/PI染色后细胞出现细胞核碎裂，染色质浓缩和细胞形态不规则等明显的早期细胞凋亡状态，药物作用后的细胞存活率由明显下降，但紫柏凝胶对于宫颈HPV阳性Siha细胞的具体作用机制尚需要进一步研究。

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Effect of Zibai gel on Siha cells proliferation inhibition and induction of apoptosis

WEN Lijuan, LI Ya, XUE Xiao’ou*
(Dongzhimen Hospital, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100700, China)

Objective To study the Zibai gel on proliferation inhibition and apoptosis of HPV positive Siha cells.Methods Siha cells in logarithmic growth phase were selected, divided into different concentrations groups (15, 7.5,3.25 mg/mL) of Siha cells, and Siha cells without medicine was used as control group. Cell growth inhibition was detected by MTS. Trypan blue staining was used to detect cell survival rate. Acridine orange / ethidium bromide(HOECHST 33342) staining method was used to detect the changes of apoptosis. Results MTS assay: The inhibitory effect of each group “Zibai gel” on Siha cell growth were different, the 3.125 mg/L dose group was statistically signif i cant compared with the control group (p＜0.05), IC50 (15±2.1) mg/mL; trypan blue staining: Zibai gel has a certain inhibitory effect on the growth of Siha cells, the inhibition rate of cell growth in each concentration group was higher than that in control group (p＜0.05); action of Zibai gel on Siha cells leads to a qualitative change between cells, loosening of cytoplasm, increase of cytoplasmic granules, condensation of chromatin and fragmentation of cytoplasm; HOECHST 33342/PI staining: the apoptosis of the cells was observed by fluorescence microscope.Conclusion Zibai gel can inhibit cervical cancer Siha cell proliferation and induce apoptosis.

Zibai gel; Siha; cell proliferation; apoptosis; MTS

R285.5

A

2095-6258(2017)06-0883-04

10.13463/j.cnki.cczyy.2017.06.008

G20工程支撑保障 “十病十药研发——紫柏凝胶用于治疗宫颈HR-HPV感染的研究与开发”（Z151100003815084）。

温利娟（1983 - ），女,博士研究生,主要从事妇科内分泌和肿瘤研究。

*通信作者：薛晓鸥,女,博士研究生导师,电话 - 13910430076,电子信箱 - pro_xue@163.com

2017-02-20）