黄 明，胡熙耀，彭 敏，朱克刚

青藤碱对家兔骨质疏松压缩性骨折模型骨生长分化因子2和血清白介素-1β及白介素-17的影响

黄 明1，胡熙耀2，彭 敏2，朱克刚3*

目的研究青藤碱对骨质疏松压缩性骨折模型家兔骨生长分化因子2(GDF2)和血清白介素-1β(IL-1β)及IL-17的影响，并探讨其作用机制。方法先将36只雌性家兔去卵巢建立骨质疏松模型，4周后再采用剪断L1-L5节段椎体前缘的方法建立骨质疏松压缩性骨折模型，成模后分为模型组，青藤碱A组、B组。青藤碱A组、B组用10%青藤碱分别按2、4 mL/(kg·d)剂量灌胃，模型组灌胃等体积生理盐水，三组均治疗1个月。采用双抗体夹心法检测耳缘静脉炎性因子IL-1β/IL-17的含量；采用酶联免疫吸附(ELISA)法检测椎间盘组织GDF2表达水平；采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)法检测椎间盘组织GDF2 mRNA表达。结果青藤碱可提高青藤碱A组、B组家兔GDF2、GDF2 mRNA表达水平，降低血清IL-1β/IL-17含量，与模型组和同组治疗前比较，差异有统计学意义(P<0.05)，但青藤碱A组、B组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论青藤碱可改善低IL-1β/IL-17介导的炎性反应及骨退行性变，提高GDF2诱导成骨分化和骨形成能力，加速骨折愈合。

青藤碱；骨质疏松压缩性骨折；骨生长分化因子2；IL-1β/IL-17；家兔

0 引言

骨质疏松属体内钙调节激素分泌失调的全身代谢性疾病，尤以50岁以上的绝经妇女最为严重，患者因钙、磷、维生素及蛋白质等摄入不足，成骨和破骨代谢失衡，骨量减少、骨微结构改变、骨强度下降且脆性增加，在外力的作用下较易发生压缩性骨折，严重影响患者的生活及生存质量[1-2]。在骨折愈合病理过程中，炎性因子IL-1β、IL-17等常影响骨折局部微环境。IL-1β在诱导软骨细胞凋亡的同时，还会诱导产生IL-17，促进软骨细胞凋亡，降解软骨细胞基质，降低成骨细胞活性，减缓骨痂形成[3]。而因子IL-17由活化的T细胞产生，可增强破骨细胞活性并最终导致骨侵蚀[4]。骨生长分化因子2(Growth differentiation factor 2，GDF2)具有诱导成骨分化和骨形成能力，在骨折愈合过程中起重要作用，GDF2对促进骨痂形成具有重要意义[5]。本文旨在研究青藤碱(Sinomenine，SIN)对骨质疏松压缩性骨折模型家兔骨折GDF2和血清IL-1β/IL-17的影响，探讨青藤碱的作用机制，为临床治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 动物与分组 SPF级雌性家兔36只，7月龄左右，体重(3.0±0.1)kg，随机分为3组(模型组,青藤碱A组、B组)，每组12只。实验动物由十堰市太和医院实验动物中心提供(合格号：4200593344)。

1.2 试剂及药品 水合氯醛(扬州市奥鑫助剂厂，批号：015102913)，盐酸青藤碱肠溶片(烟台鲁银药业有限公司，批号：2016122603)；IL-1β、IL-17、OPG和GDF2检测ELISA试剂盒均由上海信则生物科技有限公司提供。

1.3 骨质疏松动物模型及骨质疏松压缩性骨折模型建立 家兔适应性喂养1周后，用10%水合氯醛(0.2 mL/100 g)腹腔内注射麻醉，麻醉后俯卧位固定，8%硫化退毛，于家兔髂嵴顶部上方和腰椎骶棘肌两侧采用双切口方法切开家兔背肌，分离出腹腔脂肪团中包埋的卵巢和子宫角。先结扎子宫角上部，然后摘除卵巢，摘除干净后纳入脂肪团，分层缝合背肌和皮肤，用双氧水消毒。术后肌肉注射地塞米松(1 mg/kg)，2次/周，共4周[6]。术后自由摄食、饮水，恒温20～22 ℃，相对湿度40%～70%。4周后参照文献[7]方法建立骨质疏松压缩性骨折模型。建模时用10%水合氯醛(0.2 mL/100 g)腹腔内注射麻醉，双氧水消毒，切开兔L1-L5皮肤，分离家兔背阔肌、棘间肌及韧带，从椎体侧前方剪断L1-L5节段椎体前缘，术后椎体不用做内固定，2周后动物可成模。成模依据[8]：2周内强迫活动(每天6 h)，因家兔的前肢不发达，后肢及脊柱背侧肌群、腹侧肌群比较发达，且生活体位多以半直立屈曲位为主，负重集中在后肢，动物清醒后，其觅食活动、强迫运动均会使椎体受压，脊柱在此负重状态下最终会出现压缩状态而形成骨质疏松压缩性骨折。本实验在术后2周时拍摄CR，发现椎体均有明显压缩变短等病理改变，证实建模成功，符合骨质疏松压缩性骨折模型病理特征。

1.4 治疗方法 骨质疏松压缩性骨折模型成功后，青藤碱A组、B组用事先配制好的10%盐酸青藤碱肠溶片混悬液，每只家兔按2、4 mL/(kg·d)的剂量灌胃，模型组按2 mL/(kg·d)灌生理盐水，三组均治疗1个月。

1.5 观察指标 治疗前和治疗后，取耳缘静脉血0.1 mL，采用双抗体夹心法检测炎性因子IL-1β/IL-17的含量；取血后各组处死7只，取椎间盘组织制成匀浆液，采用酶联免疫吸附(ELISA)法检测椎间盘组织GDF2表达水平；采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)法检测椎间盘组织GDF2 mRNA表达。以上操作严格按ELISA试剂盒说明书操作。

2 结果

2.1 青藤碱对家兔GDF2和GDF2 mRNA的影响 模型组家兔治疗前后GDF2和GDF2 mRNA无明显变化(P>0.05)。治疗前，青藤碱A组、B组与模型组比较差异无统计学意义(P>0.05)，治疗后，两组GDF2和GDF2 mRNA均高表达(P<0.05)，与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

2.2 青藤碱对家兔IL-1β和IL-17的影响 模型组家兔治疗前后IL-1β和IL-17无明显变化(P>0.05)。治疗前，青藤碱A组、B组与模型组比较差异无统计学意义(P>0.05)；治疗后，两组IL-1β和IL-17均降低(P<0.05)，与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

3 讨论

骨形态发生蛋白(Bone morphogenetic proteins，BMPs)有15个成员，其中BMP9又称GDF2，具有诱导成骨分化和骨形成的能力，属于转化生长因子，因其可诱导骨形成而得名[9]。Kimelman-Bleich等[10]在动物实验中发现，GDF2具有诱导成骨活性的作用，具有明显的促成骨作用。IL-1β和IL-17作为炎症因子，参与机体的炎症反应。从理论上讲，抑制IL-1β和IL-17的合成，增强GDF2均有利于骨折愈合。青藤碱是从中医青风藤的干燥根茎中提取的装模单体生物碱，因其具有抗肿瘤、免疫抑制、镇痛、抗炎、抗风湿等作用，临床常用于类风湿、风湿及骨性关节炎等的治疗[11-12]。在本实验中，我们首先用雌性家兔去卵巢建立家兔骨质疏松模型，再在此基础上建立椎体压缩性骨折模型，目的是真实模拟老年女性骨质疏松椎体压缩性骨折，研究青藤碱在骨折愈合过程中是否可以通过影响GDF2和GDF2 mRNA表达及炎症因子IL-1β和IL-17合成而加速愈合。

表1 各组治疗前后GDF2和GDF2 mRNA比较(n=8)

注：与治疗前比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05

表2 各组治疗前后IL-1β和IL-17比较(pg/mL，n=8)

注：与治疗前比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05

本研究表明，青藤碱可提高A组、B组GDF2、GDF2 mRNA表达水平，降低血清IL-1β/IL-17含量。研究表明，IL-1β是一种较强的刺激骨吸收的因子，随着绝经后妇女雌激素分泌量降低，机体对于IL-1β启动因子的拮抗作用降低，故IL-1β促使骨吸收，加速骨质疏松的形成[13]。另外，在骨质疏松形成的过程中，炎症因子IL-17也可以调节骨形成和骨吸收，影响破骨细胞活性，破骨细胞分泌大量水解酶溶解骨质，使骨小梁变薄、断裂，最终形成骨质疏松[14-15]。IL-1β与IL-17在炎症反应中有联动关系，IL-1β首先激活一氧化氮合酶而产生一氧化氮，一氧化氮诱导软骨细胞凋亡，并能抑制软骨细胞增殖和合成蛋白多糖[16]。同时，IL-1β还会使T细胞活化，诱导产生IL-17而降解软骨细胞基质，降低成骨细胞活性而破坏骨微结构[17]。T细胞活化后产生的因子IL-17还可增强破骨细胞活性，并最终导致骨侵蚀而加重骨质疏松病理进程[18]。因此，抑制IL-1β与IL-17所造成炎性反应成为防治骨质疏松时骨质破坏及可能发生椎体压缩性骨折的关键。在本实验中，青藤碱通过抑制IL-1β合成和T细胞活化，间接抑制IL-17表达及分泌而产生抗炎作用，降低软骨细胞凋亡，增强成骨细胞活性而加速骨折愈合[19]。本实验还观察到青藤碱可明显提高GDF2表达。目前关于GDF2对骨质疏松的研究较少。GDF2能够诱导钙盐结节沉积，并可诱导间充质干细胞分化为骨、软骨[20-21]。本实验中，GDF2和GDF2 mRNA高表达，提示青藤碱可通过诱导骨钙沉积，提高成骨细胞活性，并有可能抑制已经成熟的破骨细胞诱导骨吸收，促成新骨及骨痂形成而加速修复动物骨质疏松椎体压缩性骨折。

综上所述，青藤碱可以通过影响GDF2和GDF2 mRNA表达及炎症因子IL-1β和IL-17合成而加速骨质疏松椎体压缩性骨折愈合，具有肯定的治疗作用，其意义在于青藤碱可能成为治疗老年女性骨质疏松椎体压缩性骨折的新药物。

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Effectofsinomenineongrowthdifferentiationfactor2ofboneandseruminterleukin-1βand-17inmodelsofosteoporoticvertebralcompressionfracturesinrabbits

HUANG Ming1,HU Xi-yao2,PENG Min2,ZHU Ke-gang3*

(1.Shiyan Hospital of Traditional Chinese Medicine,Shiyan 442002,China;2.Taihe Hospital,Hubei University of Medicine,Shiyan 442000,China;3.Department of Pharmacology, Basic Medical College of Hubei Medical College,Shiyan 442000,China)

ObjectiveTo study the effects of sinomenine on growth differentiation factor 2 (GDF2) and IL-1β and IL-17 in models of osteoporotic vertebral compression fractures in rabbits,and to explore the mechanism of action.MethodsFirst,36 female rabbits were ovariectomized to establish osteoporosis models,and after 4 weeks,the method of cutting former-edge of L1-L5 segments was used to establish fractures of vertebral compression with osteoporosis.After modeling,they were divided into model group,sinomenine group A and group B.Sinomenine group A and group B

intragastric administration of 10% sinomenine with 2 mL/(kg·d) and 4 mL/(kg·d) as dosages,model group was given normal saline,and the 3 groups were all treated for one month.Double antibody sandwich method was used to test the contents of factor IL-1β/IL-17 of ear vein inflammatory;enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) was used for the detection of expressions of GDF2 in intervertebral disc tissue;reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) was used to detect the expressions of GDF2 mRNA in intervertebral disc tissue.ResultsSinomenine could improve the expression level of GDF2 and GDF2 mRNA in group A and group B,and decrease the contents of IL-1β/IL-17 in serum (P<0.05),and there was statistically significant difference between sinomenine groups and model group (P<0.05),but there was no significant difference between group A and group B (P>0.05).ConclusionSinomenine can reduce the inflammatory reaction and bone degeneration induced by factor IL-1β/IL-17,increase the ability of GDF2 to induce osteogenic differentiation and bone formation,thus accelerating the healing of bone fractures.

Sinomenine;Osteoporotic compression fracture;Bone growth differentiation factor 2;IL-1β/IL-17;Rabbit

2017-03-23

1.湖北省十堰市中医医院，湖北 十堰 442002；2.十堰市太和医院(湖北医药学院附属医院)，湖北 十堰 442000；3.湖北医药学院基础医学院药理教研室，湖北 十堰 442000

*

10.14053/j.cnki.ppcr.201711006