王丹丹,沈 馨,董 蕴,钟小丹,张振东,郭 壮*

(1.湖北文理学院 化学工程与食品科学学院鄂西北传统发酵食品研究所,湖北 襄阳 441053;2.湖北米婆婆生物科技股份有限公司,湖北 孝感 432003)

孝感凤窝酒曲真菌多样性评价

王丹丹1,沈 馨1,董 蕴1,钟小丹2,张振东1,郭 壮1*

(1.湖北文理学院 化学工程与食品科学学院鄂西北传统发酵食品研究所,湖北 襄阳 441053;2.湖北米婆婆生物科技股份有限公司,湖北 孝感 432003)

采集了3个孝感凤窝米酒曲样品,使用Miseq高通量测序技术对其真菌微生物多样性进行了评价。在属水平上,相对含量＞0.5%的属分别为隶属于毛霉亚门(Mucoromycotina)的淀粉霉(Amylomyces)、小克银汉霉属(Cunninghamella)和毛霉属(Mucor)及隶属于子囊菌门(Ascomycota)的复膜孢酵母属(Saccharomycopsis)、曲霉属(Aspergillus)、念珠菌(Candida)、拟威尔酵母(Cyberlindnera)和接合酵母(Zygosaccharomyces)。在分类操作单元(OUT)水平上,发现26个核心OTU,包含的序列数占所有质控后合格序列数的94.32%。由此可见,孝感凤窝酒曲中的真菌微生物主要由隶属于毛霉亚门和子囊菌门的若干个真菌属构成,且米酒曲样品共有大量的核心真菌菌群。

孝感;凤窝酒曲;真菌;高通量测序

作为中国地理标识产品和湖北省非物质文化遗产代表性项目,孝感传统酿造米酒已有千年的历史,其以凤窝酒曲发酵酿制而成,并因制法独特而畅销海内外[1]。凤窝酒曲是在特定的生态环境内,用成曲作为母种培养制作而成,含有包括细菌和真菌在内的大量微生物,对米酒品质的形成起着决定性作用[2]。孝感地区现有米酒生产企业30余家,然而多数企业还是手工作坊式的生产方式,产品存在质量不稳定等诸多问题。由于发酵食品的制作多采用传统制作工艺,制作环境相对开放,所以大部分发酵食品中的微生物群落信息要比以前想象的丰富而复杂[3]。由此可见,由于米酒曲微生物群落结构的复杂性,加之发酵温度的不恒定,可能是导致孝感多数米酒企业产品质量不稳定的原因。因此,深入研究孝感凤窝酒曲中微生物的组成,对其微生物多样性信息进行全面系统的解析已成为当务之急。

众所周知,纯培养技术在微生物多样性研究方面显示出很大的片面性和局限性,变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)等指纹图谱技术虽然为认识微生物生态学提供了新的视角,然而其并不能让研究人员在一次试验中全面、平行分析多个样本中的微生物群落信息[4]。以Illumina MiSeq为代表的第二代高通量测序技术弥补了上述技术的不足,具有操作简单、成本低和结果可行度高的优势,目前已在酸奶[5]、腊肠[6]、窖泥[7]、泡菜[8]、黑茶[9]和葡萄酒[10]等微生物多样性研究中有了广泛的应用。

本项目以孝感凤窝酒曲为研究对象,在提取样品宏基因组脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,DNA)的基础上,使用引物对真菌18S rRNA V4-V5区进行聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增,在使用Miseq高通量测序平台进行序列测序的基础上,结合生物信息学手段对其真菌多样性进行揭示,以期为后续孝感米酒品质的提升及米酒用复合发酵剂的制备提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

5×TransStartTM、脱氧核糖核苷三磷酸(deoxy-ribonucleoside triphosphate,dNTP)Mix、FastPfu Buffer、FastPfu Fly DNA聚合酶:北京全式金生物技术有限公司;DNA 1000试剂盒:美国Agilent公司;QIAGENDNeasymericonFoodKit:德国QIAGEN公司。

1.2 仪器与设备

2100芯片生物分析仪:美国Agilent公司;5810R台式高速冷冻离心机:德国Eppendorf公司;DYY-12电泳仪:北京六一仪器厂;Miseq高通量测序平台:美国Illumina公司;ND-2000C微量紫外分光光度计:美国Nano Drop公司;UVPCDS8000凝胶成像分析系统:美国BIO-RAD公司;Vetiri梯度基因扩增仪:美国AB公司。

1.3 试验方法

1.3.1 样品采集

从湖北省孝感市孝南区九真和大东门农贸市场购买3个凤窝酒曲,样品采集后置于含有冰袋的采样箱中冷链运送回实验室。

1.3.2 DNA提取

取3g采集的米酒曲粉碎后加入27 mL0.01 mol/LpH值为7.4的磷酸盐缓冲溶液,置于4℃冰箱中放置2 h后400×g离心10 min后取上清液,上清液于3 000×g离心10 min后收集菌体,采用QIAGEN DNeasy mericon Food Kit试剂盒进行微生物宏基因组DNA提取,浓度和纯度均符合要求的DNA样品置于-20℃保存备用。

1.3.3 PCR扩增及Miseq高通量测序

18S rRNA PCR扩增体系为:4 μL 5×PCR缓冲液,2 μL 2.5mmol/LdNTP,0.8μL5μmol/L正向引物,0.8μL5μmol/L反向引物,0.4 μL 5 U/μL DNA聚合酶,10 ng DNA模板,体系用ddH2O补充至20 μL。正向引物为SSU0817F(5′-TTAGCATGGAATAATRRAATAGGA-3′),反向引物为SSU1196R(5′-TCTGGACCTGGTGAGTTTCC-3′),引物对18S rRNA V4-V5区进行扩增,扩增长度为379 bp,其中在正向引物中加入7个核苷酸标签(barcode)。

扩增条件为:95℃、3 min;95℃、30 s,55℃、30 s,72℃、45 s,30个循环;72℃、10 min,经1.0%琼脂糖凝胶电泳检验合格的PCR扩增产物稀释至100 nmol/L,并寄往上海美吉生物医药科技有限公司使用Miseq平台进行高通量测序。

1.3.4 序列的拼接及质控

(1)Miseq数据下机后,依据序列之间的重叠关系将两条对应的双端序列拼接成一条序列,在拼接过程中若重叠区的碱基数＜10 bp或最大错配比率＞0.2,或barcode碱基发生错配,或引物碱基错配数＞2 bp,则该序列予以剔除;(2)根据barcode信息将每条拼接好的序列划分到每个样品并对序列方向进行校正;(3)将拼接好的序列中的barcode和引物切除,若切掉barcode和引物后序列碱基数＜50 bp,则该拼接好的序列亦予以去除。

1.3.5 生物信息学分析

将3个样品经过拼接和质控的序列合并成一个序列文件,使用QIIME(v1.7.0)分析平台[11]进行物种鉴定和相对含量分析。使用PyNAST[12]软件将所有序列对齐后,采用两步UCLUST算法[13]分别以100%和97%的相似度进行序列划分并建立分类操作单元(operationaltaxonomicunits,OTU),继而从每个OTU中选取1条代表性序列,使用SILVA[14-15]数据库进行比对,继而获得样品中真菌微生物各分类地位学的信息,并使用FastTree软件[16]绘制基于代表序列的系统发育进化树,最终对米酒曲中真菌微生物的香农指数(Shannonindex)、发现物种数(ObservedSpecies)和超1指数(Chao1 index)等α多样性指标进行计算。

1.3.6 优势和核心菌群的定义

若隶属于某一真菌门、真菌属或OTU的微生物类群在3个孝感凤窝酒曲样品中均存在,则定义为核心菌群;若该真菌类群平均含量＞0.5%,则将其定义为优势菌群;若该类群在3个样品中均存在且平均含量＞0.5%,则定义为优势核心菌群。

1.3.7 核酸登录号

本研究中所有高通量测序数据均已提交至MG-RAST数据库,ID号为mgp 80403。

1.3.8 数据处理

采用在线工具Venny 2.1(http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)绘制维恩(Venn)图;采用Mega5.0软件绘制核心OTU系统发育树;采用R软件作图绘制热图;其他图采用Origin 8.6软件绘制。

2 结果与分析

2.1 序列丰富度和多样性分析

本研究的3个孝感凤窝酒曲样品18S rRNA测序情况及各分类地位数量如表1所示。

表1 样品18S rRNA测序情况及各分类地位数量Table 1 18S rRNA sequencing conditions of samples and number of classifications at different taxonomical levels

由表1可知,本研究采集的3个孝感凤窝酒曲样品共产生了83 198条高质量18S rRNA序列,平均每个样品产生27 733条。根据100%的相似性进行序列划分共得到13 445条代表性序列,根据序列的97%相似性进行分类操作单元(OTU)划分后,共得到126个OTU,每个样品平均66个。通过稀疏曲线和香农指数曲线图对产生的数据量是否满足后续生物信息学分析进行了评价,其结果如图1所示。

图1 稀疏曲线图(A)和香农指数曲线图(B)Fig.1 Rarefaction curve(A)and Shannon diversity index curve(B)

由图1A可知,随着测序量的增加孝感凤窝米酒曲中发现真菌物种的数量也增加,这说明随着测序深度的加大,新的真菌种系型可能会被发现。由图1B可知,在测序量到1 000条的时候,香农指数曲线就已经进入了平台期,这说明随着测序深度的加大,物种的多样性不再随之变化了。由此可见,本研究中每个样品产生27 733条18S rRNA序列的测序深度是可以满足后续生物信息学分析要求的。

2.2 基于不同分类地位核心真菌菌群相对含量的分析

在采用UCLUST进行序列两步划分的基础上,本研究进一步使用SILVA数据库对每个OTU包含的代表性序列进行了同源性比对,并对各OTU包含序列数的相对含量进行了计算。纳入本研究的83 198条序列,所有的序列鉴定为3个门,7个纲,7个目,17个科和27个属,仅有0.76%的序列不能鉴定到属水平。在门水平上,所有的序列鉴定为子囊菌门(Ascomycota)、担子菌亚门(Basidiomycota)和毛霉亚门(Mucoromycotina),其平均含量分别为46.90%、0.03%和53.08%,其中子囊菌门(Ascomycota)和毛霉亚门(Mucoromycotina)在3个样品中均存在。由此可见,孝感凤窝酒曲中真菌主要由隶属于子囊菌门(Ascomycota)和毛霉亚门(Mucoromycotina)的菌群构成。值得一提的是,3个样品中隶属于子囊菌门(Ascomycota)的真菌相对含量分别为60.45%、4.87%和75.38%,隶属于毛霉亚门(Mucoromycotina)的真菌相对含量分别为39.47%、95.13%和24.62%,因而在门水平上不同凤窝酒曲样品中真菌微生物的构成存在较大的差异。基于属水平3个凤窝酒曲样品中优势真菌的相对含量如图2所示。

图2 孝感凤窝酒曲中优势真菌属相对含量的比较分析Fig.2 Comparative analysis on the relative contents of the dominant fungal genera in Xiaogan Fengwo rice wine koji

由图2可知,纳入本研究的3个孝感凤窝酒曲样品中优势真菌属分别为隶属于毛霉亚门(Mucoromycotina)的淀粉霉(Amylomyces)、小克银汉霉属(Cunninghamella)和毛霉属(Mucor),其平均相对含量分别为49.06%、1.44%和1.14%;及隶属于子囊菌门(Ascomycota)的复膜孢酵母属(Saccharomycopsis)、曲霉属(Aspergillus)、念珠菌(Candida)、拟威尔酵母(Cyberlindnera)和接合酵母(Zygosaccharomyces),其平均相对含量分别为32.12%、10.07%、1.44%、1.37%和1.16%。上述8个优势真菌属的累计平均相对含量为97.80%,其他19个属的平均相对含量累计为1.44%。由此可见,孝感凤窝酒曲中的真菌微生物主要由隶属于毛霉亚门(Mucoromycotina)和子囊菌门(Ascomycota)的若干个属构成。

近些年来,国内学者对我国信阳[17]、广东[18]、黑龙江[19]以及陕北地区[20]米酒或者米酒曲中微生物的多样性开展了多项卓有成效的研究,均认为霉菌和酵母菌是其中的优势菌。部分学者以孝感地区米酒或凤窝酒曲为研究对象进行了相关研究工作:况启生等[21]采用传统分离方法对孝感民间米酒的微生物多样性进行了研究,共分离出包括霉菌、酵母菌、乳酸菌和芽孢杆菌在内的13个属、36个种的微生物菌株,这在一定程度上也说明了孝感米酒具有较高的微生物多样性;采用传统分离鉴定和平板菌落计数法,王艳萍等[22]对来自孝感的米酒醪中的微生物进行了研究,发现霉菌和酵母菌是米酒发酵过程中间的优势菌;王小红等[2-3]对凤窝酒曲中酵母菌和根霉进行了分离鉴定,研究发现,酿酒酵母和假丝酵母为其中的优势酵母菌属;蔡丽等[23]亦对凤窝酒曲中根霉进行了分离鉴定,分离到6株米根霉(Rhizopus oryzae)和7株华根霉(Rhizopus chinesis)。

本研究进一步对平均相对含量＞0.5%且在3个样品中均存在的核心真菌属进行了统计分析,其结果如图3所示。

图3 孝感凤窝酒曲中优势核心真菌属相对含量的比较分析Fig.3 Comparative analysis on the relative contents of the core fungal genera in Xiaogan Fengwo rice wine koji

由图3可知,隶属于毛霉亚门(Mucoromycotina)的淀粉霉(Amylomyces),隶属于子囊菌门(Ascomycota)的复膜孢酵母属(Saccharomycopsis)、曲霉属(Aspergillus)、接合酵母(Zygosaccharomyces)和念珠菌(Candida)为纳入本研究的3个孝感凤窝酒曲中优势核心真菌菌群,上述5个真菌属在MZ1、MZ2和MZ3中的累计相对含量分别为88.50%、99.50%和93.60%。这也进一步证实了,孝感凤窝酒曲共有大量的核心真菌菌群。不仅在中国,在韩国、日本、印度尼西亚和越南等亚洲国家也有饮用米酒的习惯,虽然在不同的国家,米酒的名字及原料可能不同,但其发酵工艺流程是相似的。SUJAYA I N等[24]采用纯培养的方法发现酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是印尼地区米酒Brem发酵过程中的优势酵母菌株。采用相同的方法,DUNG N T P等[25]对越南的米酒Men进行了研究,认为酵母菌和霉菌是其中的优势菌群。本研究进一步统计了OTU在3个样品中出现的次数,其结果如图4所示。

图4 OTU在孝感凤窝酒曲样品中出现次数统计Fig.4 Occurrence frequency statistics of OTU in Xiaogan Fengwo rice wine koji

由图4可知,3个孝感凤窝酒曲样品共产生126个真菌OTU,其中核心OTU有26个,占OTU总数的20.64%,分别出现2次和1次的OTU分别有20个和80个,分别占OTU总数的15.87%和63.49%。基于OTU水平的维恩图如图5所示。

图5 基于OTU水平的维恩图Fig.5 Venn diagram based on OTU level

由图5可知,虽然纳入本研究的3个孝感凤窝酒曲样品中共发现了26个真菌的核心OTU,仅占OTU总数的20.63%,但其包含了78473条序列,占所有质控后合格序列数的94.32%。MZ1、MZ2和MZ3特有的OTU数量分别为50个、10个和20个,包含的序列数分别为750条、11条和1 085条。在3个样品中仅出现2次的OTU,其中MZ1和MZ2共有11个OTU和1 654条序列,MZ1和MZ3共有20个OTU和1 085条序列,MZ2和MZ3无共有OTU。综上所述,在3个孝感凤窝酒曲样品中出现2次和1次的OTU所包含序列数分别为2 739条和1 846条,分别占所有质控后合格序列数的3.29%和2.22%。由此可见,纳入本研究的3个孝感凤窝酒曲共有大量的核心真菌菌群,虽然有的米酒曲中可能含有一些较为独特的真菌种系型,但其相对含量是极低的。在26个核心OTU中相对含量＞0.5%的OTU共有6个,依据OTU的进化关系建立了系统发育树,结果如图6所示。

图6 相对含量大于0.5%的核心OTU在各孝感凤窝酒曲样品的系统发育树Fig.6 Phylogenetic tree of the core OTU with relative abundance more than 0.5%in Xiaogan Fengwo rice wine koji

由图6可知,6个相对含量＞0.5%的核心OTU中,各有1个隶属于复膜孢酵母属(Saccharomycopsis)和念珠菌(Candida)、各有2个隶属于曲霉属(Aspergillus)和淀粉霉(Amylomyces)。在3个孝感凤窝酒曲样品中OTU102(隶属于复膜孢酵母属)的相对含量分别为17.88%、3.96%和72.99%,OTU100(隶属于曲霉属)的相对含量分别为24.83%、0.25%和0.28%,OTU57(隶属于淀粉霉)的相对含量分别为33.09%、94.12%和17.50%。上述3个核心OTU的累计相对含量分别为75.80%、98.33%和90.78%。由此可见,虽然孝感凤窝酒曲样品共有大量的核心真菌菌群,但核心真菌菌群的多样性相对较低,3个核心OTU的相对含量就占到了真菌类群的接近90%。本研究进一步对相对含量＞0.5%的核心OTU之间的相关性进行了分析,其结果如图7所示。

图7 相对含量大于0.5%的核心OTU相关性的聚类树Fig.7 Clustering tree of correlation among the core OTU with relative abundance more than 0.5%

由图7可知,OTU116(隶属于念珠菌属)与OTU100(隶属于曲霉属)呈显著正相关(R2=0.9997,P=0.011),与OTU83(隶属于曲霉属)呈非常显著正相关(R2=0.999 9,P=0.007),OTU100(隶属于曲霉属)与OTU83(隶属于曲霉属)亦呈显著正相关(R2=0.999 1,P=0.018)。除此之外,其他相对含量＞0.5%的核心OTU之间无显著相关性(P＞0.05)。

3 结论

在提取样品宏基因组DNA的基础上,本研究使用高通量测序技术,以18S rRNA V4-V5区为测序靶点,对孝感凤窝酒曲中真菌微生物多样性进行了评价。结果发现,孝感凤窝酒曲中的真菌微生物主要由隶属于毛霉亚门和子囊菌门的淀粉霉属、小克银汉霉属、毛霉属、复膜孢酵母属、曲霉属、念珠菌、拟威尔酵母和接合酵母属的8个属组成,且酒曲样品共有大量的核心真菌菌群。通过本研究的开展,可为后续孝感米酒品质的提升和米酒用复合发酵剂的制备提供一定理论参考。

[1]谈生安.孝感米酒工艺技术[J].食品工业科技,1998,19(1):64-65.

[2]王小红,徐 康,赵 山,等.孝感凤窝酒曲中酵母菌的分离及特性研究[J].现代食品科技,2008,24(2):134-137.

[3]王小红,王 莹,赵 山,等.孝感凤窝酒曲中根霉的分离及特性研究[J].中国酿造,2008,27(13):21-24.

[4]COCOLIN L,ALESSANDRIA V,DOLCI P,et al.Culture independent methods to assess the diversity and dynamics of microbiota during food fermentation[J].Int J Food Microbiol,2013,167(1)：29-43.

[5]智楠楠.Illumina Miseq平台深度测定酸奶中微生物多样性[J].食品工业科技,2016,37(24):78-82.

[6]JUSTYNA P,ANNALISA R,VINCENZA P,et al.Bacterial diversity in typical Italian salami at different ripening stages as revealed by highthroughput of 16S rDNA amplicons[J].Food Microbiol,2015,46(4)：342-356.

[7]HU X,DU H,REN C,et al.Illuminating anaerobic microbial community and cooccurrence patterns across a quality gradient in Chinese liquor fermentation pit muds[J].Appl Environm Microbiol,2016,82(8)：2506-2515.

[8]YANG H,WU H,GAO L,et al.Effects ofLactobacillus curvatusand Leuconostoc mesenteroideson Suancai fermentation in northeast China[J]. J Microbiol Biot,2016,26(12)：2148-2158.

[9]FU J,LV H,CHEN F.Diversity and variation of bacterial community revealed by MiSeq Sequencing in Chinese dark teas[J].PloS One,2016,11(9)：e0162719.

[10]BOYNTON P J,GREIG D.Fungal diversity and ecosystem function data from wine fermentation vats and microcosms[J].Data Brief,2016,8(12)：225-229.

[11]CAPORASOJ G,KUCZYNSKIJ,STOMBAUGHJ,et al.QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data[J].Nature Meth,2010,7(5)：335-336.

[12]CAPORASO J G,BITTINGER K,BUSHMAN F D,et al.PyNAST：a flexible tool for aligning sequences to a template alignment[J].Bioinformatics,2010,26(2)：266-267.

[13]EDGAR R C.Search and clustering orders of magnitude faster than BLAST[J].Bioinformatics,2010,26(19)：2460-2461.

[14]QUAST C,PRUESSE E,YILMAZ P,et al.The SILVA ribosomal RNA gene database project:improved data processing and web-based tools[J].Nucleic Acid Res,2012,41(1)：590-596.

[15]YILMAZP,PARFREYLW,YARZAP,etal.TheSILVAand"all-species living tree project(LTP)"taxonomic frameworks[J].Nucleic Acid Res,2014,42(D1)：643-648.

[16]PRICE M N,DEHAL P S,ARKIN A P.Fasttree：computing large minimum evolution trees with profiles instead of a distance matrix[J].Mol Biol Evol,2009,26(7)：1641-1650.

[17]李福荣.信阳米酒微生物群落组成[J].信阳师范学院学报:自然科学版,2005,18(1):52-53.

[18]李健容,蔡爱群.民间传统酒曲主要微生物的分离及鉴定[J].酿酒科技,2007,28(5):111-115.

[19]焦晶凯.传统酿造米酒微生物多样性及优势菌特性的研究[D].哈尔滨:哈尔滨工业大学,2012.

[20]郝 莹,王卫卫,王莉娟,等.陕北传统米酒曲中优势菌种的分离,纯化及鉴定[J].检验检疫科学,2010,19(2):44-47.

[21]况启生,李安明,戴余军,等.孝感民间传统米酒菌株的分离,鉴定与筛选,培养[J].食品科学,2003,24(9):94-96.

[22]王艳萍,程巧玲,张 阳,等.米酒醪中优势微生物菌相组成的初步研究[J].中国酿造,2008,27(5):12-14.

[23]蔡 丽,易 响,陈福生,等.传统米酒酒曲的评价及根霉的分类鉴定[J].中国酿造,2010,29(12):30-33.

[24]SUJAYA I N,ANTARA N S,SONE T,et al.Identification and characterization of yeasts inbrem,a traditional Balinese rice wine[J].World J Microbiol Biot,2004,20(2)：143-150.

[25]DUNG N T P,ROMBOUTS F M,NOUT M J R.Characteristics of some traditional Vietnamese starch-based rice wine fermentation starters[J].LWT-Food Sci Technol,2007,40(1)：130-135.

WANG Dandan1,SHEN Xin1,DONG Yun1,ZHONG Xiaodan2,ZHANG Zhendong1,GUO Zhuang1*
(1.Northwest Hubei Research Institute of Traditional Fermented Food,College of Chemical Engineering and Food Science,Hubei University of Arts and Science,Xiangyang 441053,China;2.Hubei Granny Mi Biotechnology Co.,Ltd.,Xiaogan 432003,China)

TS262.4

0254-5071(2017)11-0038-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.11.009

2017-08-09

湖北省教育厅科学技术研究计划中青年人才项目(Q20152603)

王丹丹(1996-),女,本科生,研究方向为食品生物技术。

*通讯作者:郭 壮(1984-),男,副教授,博士,研究方向为食品生物技术。