夏立平 秦 阳 叶文琴

1.江苏医药职业学院护理学院,江苏盐城 224005;2.海军军医大学附属长海医院,上海 200433

口腔定植菌检测技术的系统评价

夏立平1秦 阳1叶文琴2▲

1.江苏医药职业学院护理学院,江苏盐城 224005;2.海军军医大学附属长海医院,上海 200433

目的寻找适合机械通气(MV)患者口腔定植菌的检测方法,完善MV患者口腔护理评估方法.方法使用计算机检索2005年1月～2015年4月的文献,对纳入研究的文献的进行阅读,并遵循quot;系统综述和荟萃分析优先报告条目quot;声明对研究内容进行系统评价.结果最终纳入7篇文献,其中4篇中文文献,3篇英文文献.口腔定植菌检测方法有涂片镜检法、细菌培养法、菌落形成单位法,以及DNA探针和PCR技术.结论16SrDNA/16SrRNA检测技术能够大大提高口腔微生物的鉴定成功率,具有广阔的应用前景.

机械通气;口腔定植菌;检验技术;文献检索;16SrDNA/16SrRNA

机械通气(mechanical ventilation,MV)是利用机械装置来控制、代替或改变自主呼吸运动的一种通气方式[1].在呼吸机的帮助下,通过机械通气维持气道通畅、改善通气和氧合、防止机体缺氧和二氧化碳蓄积,帮助机体度过基础疾病所致的呼吸功能衰竭,为治疗基础疾病创造条件[2-3].有研究显示,口咽部定植菌的误吸和移位是MV患者发生VAP的独立危险因素,根据口咽部微生物的种类,有针对性地进行口腔护理干预,可以显著降低VAP的发生率[4-6].之前本研究组对于MV患者口腔护理的指南和系统评价进行循证研究,均未发现有关口腔定植菌检测技术的相关证据,为寻找适合MV患者口腔定植菌的检测方法,完善MV患者口腔护理评估方法,本研究针对口腔定植菌检测技术进行系统评价,分析现有的口腔定植菌检测方法的准确性及应用效果,以总结出文献报道中的不同检测手段,并对其检测效果进行分析,为构建MV患者口腔护理方案提供理论依据.

1 资料与方法

1.1 评价标准

遵循quot;系统综述和荟萃分析优先报告条目quot;(Preferred Reporting Items for Systematic reviews and Meta-Analyses,PRISMA)声明来制定该系统评价的研究内容.该声明是对系统评价或荟萃分析报道内容的主要条目进行界定和介绍,旨在帮助改进此类文章的撰写,提升系统评价或荟萃分析的质量[7].

1.2 纳入与排除标准

本系统评价针对口腔定植菌的检测技术展开,纳入文献特征包括:(1)使用检测方法调查口腔定植菌的种类或数量的相关实验性和观察性研究;(2)研究对象为人类,限定范围为口腔细菌,其种族、国籍不限;③同时纳入中英文文献.主要的检测方法包括:细菌培养法、细菌酶检测法、免疫学检查技术、DNA探针杂交技术、聚合酶链反应技术(PCR技术)等.排除标准为:(1)细菌检测对象为动物;(2)未说明检测结果指标,如检出率或特异度等.

1.3 检索策略

使 用 计 算 机 检 索 Cochrane Library、Pubmed、EMbase、CBM、万方数据库,所有数据库均为近十年,即2005年1月1日～2015年4月.对纳入研究文献的参考文献进行阅读,保留与本系统评价相关的研究,并对其中不明确或无法获得原文的文献与作者进行联系.英文检索词包括:(oral colonized bacteria / oral colonization)amp;(testing method/bacterial culture/bacterial enzyme test/immunology examination/DNA probe hybridization/polymerase chain reaction/16SrRNA/denaturing gradient gel electrophoresis/gene chip/16SrDNA)amp;(detection rate/sensitivity/specificity/accuracy);中文检索词包括:口腔定植菌、检测方法/细菌培养法/细菌酶检测法/免疫学检查技术/DNA探针杂交技术/聚合酶连反应技术(其中包括传统PCR、半定量和定量PCR)/16S rRNA基因/变性梯度凝胶电泳技术/基因芯片技术、检出率/敏感度/特异度/精确性.以Pubmed为例,说明检索过程,见图1.

图1 检索过程

1.4 文献筛选

由两位接受过循证护理培训的研究人员分别独立进行筛选,首先阅读文题,若符合纳入标准则进一步阅读摘要、全文,并在此基础上交叉核对.对存在分歧的点由第三位人员协助判断.

1.5 内容提取

设计信息提取表,对纳入的文献提取以下内容:(1)文献基本特征,包括作者、发表时间、研究类型、研究对象特征;(2)定植菌检测相关特征,如检测方法、定植菌种类、检测的结局指标(包括检出率、特异度等).

1.6 文献质量评价

两位研究人员分别对筛选后保留的文献进行质量评价,采用由参与上一步的两名研究人员按照QUADAS-2(Quality Assessment of Diagnostic Accuracy Studies)质量评价标准对纳入文献进行评价[7].该工具主要用于诊断试验准确性的评价,是Cochrane协作网推荐的诊断试验系统评价方法学组采用的工具,并在2012年被纳入Cochrane协作网专用软件RevMan5.2中[8-9].QUADAS-2工具分为四个步骤:(1)研究者报道所要进行的系统评价问题;(2)根据系统评价的问题适当删增,使其能够适用于该问题;(3)评价已发表的原始研究的流程图或为未报道的原始研究构建流程图;(4)判断研究的偏倚和适用性.在对偏倚风险和临床适用性进行评价时,包含以下4个部分内容:患者的选择、待评价的试验、参考的标准、病例流程及进展,每个部分包含若干个评价问题,具体见结果中相关报道[10].

1.7 资料分析

采用Cochrane协作网中的RevMan 5.3软件进行数据处理,选择其中的诊断试验准确性回顾的模式,完成质量评价部分工作.由于Revman中无法对不同诊断试验的准确度指标进行合并分析[11],因此仅对各检测方法的结果进行描述性分析.

2 结果

2.1 文献检索结果

经过初检,得到相关文献177篇,对以上文献标题进行阅读,剔除97篇文献,对保留的80篇文献进行摘要和全文筛选,最终纳入7篇文献,其中中文文献4篇,英文文献3篇.文献筛选的过程见图2.

2.2 文献基本特征及质量评价

图2 文献筛选流程及结果

图3 纳入文献质量评价(总体)

图4 纳入文献质量评价(纳入的每项研究)

纳入研究中的基本特征主要包括:作者及年限、研究类型、研究对象、研究方法、样本量、检出的微生物种类以及结局指标,其中由于各文献中报道的结果统计指标各不相同,故未统一分类列出,结局指标以检出率为主.表格中总结了对口腔定植菌的10种检测技术,共计474例研究对象,具体见表1.

纳入文献的方法学质量评价总体结果见图3和图4,其中包含了两部分评价结果,图3是对7篇纳入文献的总体质量评估结果,主要从偏倚和适用性进行评价;图4是分别对7篇文献的每一个评估条目进行具体评分的结果.

表1 纳入文献一般特征

3 讨论

3.1 文献检索

在确定关键检索词的过程中,研究者首先尝试使用quot;口腔定植菌quot;及quot;检测方法quot;两个相关检索词,但在最初的粗略查找文献过程中发现,这一检索方法导致检索范围过大,纳入了一些并非对检测方法进行研究的文献,如对某种细菌的特性进行研究.而加入quot;气管插管quot;这一关键检索词进行限定时,又导致检出结果过少.因此,为增强对检测方法研究的检出率,故将结局指标(如quot;检出率quot;quot;特异性quot;quot;灵敏性quot;quot;准确性quot;)等加入检索词.在此基础上进行检索的结果针对性较好,经过严格的筛选过程,最终保留了7篇中英文文献.

3.1.1 文献质量 在文献质量评价的过程中,由于Kishi的研究[18]中采用了新的口腔中硫化物浓度测定方法来判断口腔细菌种类,但其结果分析过程中主要针对硫化物浓度对吸烟人群的相关性进行分析,而未报道硫化物测定结果与口腔细菌种类的关系,因此对该研究的质量评价结果,两位评价员存在分歧,经第三位具有一定循证护理研究经验的人员进行协助评判,最终给予适用性欠佳的评价结果.对于另外一篇Aas的研究文献[16],其使用了16SrRNA测序法来进行细菌检测,文章中仅提到了对照方法为不依赖培养分子分析技术,但其对照组报道的结果在以往发表的文章中进行了说明.由于在检索时将时间范围限定在2005年1月1日～2015年4月,因此没有包含对照组文献,故对不依赖培养分子分析技术的报道追溯参考文献,重新阅读其研究方法与结果,在进行质量评价时将其作为参照检测方法,从而得出评价结果.

纳入的研究均详细说明了研究对象的基本特征、口腔样本采集方法、细菌培养方法等,采用DNA探针或PCR引物技术的还详述了模板DNA制备、PCR引物选择与扩增方法等,文章质量尚可.各研究中的研究对象均不同,因此纳入研究中不同的检测方法对特定人群的适应性差异较大.

3.1.2 纳入文献的基本特征 由于本系统评价针对的是检测技术,因此并未规定检测细菌的种类,因此文献在菌种的报道上较为丰富,除了口腔中常见的伴放线杆菌、福塞氏杆菌、具核梭杆菌、牙龈卟啉单胞菌,还包括用于诊断其他疾病的细菌,如结核杆菌、幽门螺杆菌等.由于口腔中的各种微生物种类繁多,因此受不同疾病影响导致口腔中的主要菌群差异明显.Aas的研究[16]结果显示,使用16SrRNA技术可以测出141种口腔细菌,实际上人类口腔中细菌种类还要丰富.王忠朝等人的研究[14]直接采用了三种菌种的标准株来进行实验,而并未在特定人群中进行菌株采集,但由于以上三种菌种均为口腔常见细菌,对本系统评价的结果没有影响,故该文献同样予以保留.现有的关于口腔定植菌或微生物检测方法中,大多数是针对口腔疾病进行的研究,如牙周炎、口腔正畸治疗等;同时纳入的7篇文献中研究对象同时包括正常人群与异常人群,但其中异常人群并未包含需经气管插管或机械通气的危重患者,因此该类患者常见的定植菌种类亦有待进一步研究.

3.2 口腔定植菌检测方法

以上7篇文献中基本包括了当前主要应用的几种口腔定植菌检测方法,如传统的涂片镜检法、细菌培养法、菌落形成单位法,以及应用越来越广泛的DNA探针和PCR技术.

张晓娟研究[12]发现,涂片法对结核杆菌的阳性检出率仅为DNA探针杂交法的一半,其差异具有统计学意义;同时涂片法的检测周期较长,常需要2～3个月完成.相比之下,使用DNA探针的方法不仅提高了检出率,还大大缩短了检测时间,能够满足临床需要.DNA探针能够与样本中经过处理的微生物DNA单链杂交配对[19],其特异性能够大大增加检测的敏感程度,使检出菌种远高于常规的涂片法.

黄香娥等[13]使用了多重PCR方法与细菌培养法,对口腔中四种常见细菌进行检测.传统的细菌培养法虽然是标准检测方法,但由于不同细菌所需的培养条件迥异,因此尽管该研究中使用的扩增细菌DNA方法的检出效果与标准方法结果类似[20],作者仍推荐将前者应用于临床检测口腔细菌.该研究中使用的多重PCR能够通过设计多个引物,扩增多种细菌,大大提高了PCR检出的效率.

王忠朝等[14]在对三种常见的口腔细菌进行检测时使用了噻唑蓝(Magnetic Tape Terminal ,MTT)法,同时选择菌落形成单位法作为参照标准.MTT法除了用于检测细胞增殖和细胞活性,还可以对体外培养的细菌测量其毒性.其原理是通过活细胞线粒体的琥珀酸脱氢酶还原MTT,使其形成结晶;使用酶标仪测定其光吸收值,吸光度越大,形成的结晶越多,意味着细胞活性越强.该方法在最佳波长时误差最小,测定的结果最为准确[21].但由于其对细菌浓度有要求,因此在符合要求的浓度范围内检测效果较好,而达不到要求浓度时该方法也存在一定的缺陷.

张泽等[15-18]均在其使用了16SrRNA片段扩增方法,该方法实际上也是PCR技术中的一种,由于这一段基因序列高度保守,因此其一般用作细菌分类的金标准.据估计,人类口腔中存在的微生物有接近700种[22],在Aas的研究[16]中,使用16SrRNA检出了141种口腔微生物,具有极高的灵敏度.另外,该方法还避免了传统的细菌培养与分离过程中耗时、多种微生物混杂难以分离的缺点,大大方便了临床应用.实际上,在文献检索过程中也有一些报道使用了本课题中采用的16SrDNA作为引物片段进行细菌检测,但由于其未符合本研究的纳入标准,故以上进行质量评价的文章中并未有对该方法的介绍和研究.这两种方法均具有较强的检出率,并且相比之下应用16SrDNA片段序列分析能够大大提高少见菌种的鉴定成功率,比16SrRNA有着更为广阔的应用前景.

除了以上文献中采用的检测方法,其他的常用的方法还包括:酶学方法(针对一组致病菌产生的酶,无法到具体的某个细菌)、免疫学技术(如荧光标记或酶联免疫反应,该方法很大程度上依赖于试剂盒的质量)、细菌基因芯片技术等[23].

[1] 张舸,冯彬彬,陆志华,等.机械通气患者下呼吸道念珠菌去定植治疗对预后的影响[J].中华医学杂志,2017,97(28):2198-2201.

[2] 叶锐良,金同新,刘卫明,等.有创-无创序贯性机械通气治疗创伤性急性呼吸窘迫综合征的效果评价[J].中国医药科学,2017,7(7):162-164.

[3] 郭凤英,徐思成,刘光明,等.有创-无创序贯性机械通气对高龄重症社区获得性肺炎患者预后的影响[J].中华危重病急救医学,2015(7):595-600.

[4] Lisboa T,Diaz E,Sa-Borges M,et al.The ventilatorassociated pneumonia PIRO score: a tool for predicting ICU mortality and health-care resources use in ventilatorassociated pneumonia[J].Chest,2008,134(6):1208-1216.

[5] Munro CL,Grap MJ,Jones DJ,et al.Chlorhexidine,toothbrushing,and preventing ventilator-associated pneumonia in critically ill adults[J].Am J Crit care,2009,18(5):428-437.

[6] Garcia R.A review of the possible role of oral and dental colonization on the occurrence of health care-associated pneumonia:Underappreciated risk and a call for interventions[J].Am J Infect Control,2005,33(9):527-541.

[7] 刘银春,葛龙,李雅睿,等.PRISMA声明在评价枟循证医学枠刊载的干预类系统评价/荟萃分析报告质量中的应用[J]. 中华医学图书情报杂志,2014,23(4):24-27.

[8] 李婷园,张烁.放大内镜结合窄带成像技术评估早期食管癌浸润深度价值的 Meta 分析[J].中国内镜杂志,2016,22(9):1-5.

[9] 邬兰,张永,曾宪涛.QUADAS-2在诊断准确性研究的质量评价工具中的应用[J].湖北医药学院学报,2013,32(3):201-208.

[10] Penny F Whiting,Marie E Weswood,Anne WS Rutjes,等.QUADAS评价:一种用于诊断性研究的质量评价工具(修订版)[J].中国循证医学杂志,2007,7(7):531-536.

[11] RevMan.Version 5.3.Copenhagen:The Nordic Cochrane Centre[J].The Cochrane Collaboration,2014:49.

[12] 张晓娟.DNA探针杂交技术与涂片镜检法检测结核杆菌对比分析[J].中国误诊学杂志,2008,8(27):6607-6608.

[13] 黄香娥,韩谅,肖水清.多重PCR技术在正畸治疗患者口腔细菌检测中的应用[J].山东大学学报(医学版),2010,48(6):76-79,83.

[14] 王忠朝,范丽苑,蒋俊强,等.噻唑蓝比色法检测变异链球菌、血链球菌、伴放线菌嗜血菌的研究[J].华西口腔医学杂志,2010,28(3):306-310.

[15] 张泽,郑巍薇,赵晓航.长远航作业人员口腔细菌16SrRNA测序[J].中国卫生检验杂志,2015,25(11):1681-1684.

[16] AasJA,Paster BJ,Stokes LN,et al.Defining the normal bacterial flora of the oral cavity[J].J ClinMicrobiol,2005,43(11):5721-5732.

[17] Chaudhry S,Idrees M,Izhar M,et al.Simultaneous amplification of two bacterial genes:more reliable method of Helicobacter pyloridetection in microbial rich dental plaque samples[J].CurrMicrobiol,2011,(62):78-83.

[18] Kishi M,Ohara-Nemoto Y,Takahashi M,et al.Prediction of periodontopathic bacteria in dental plaque ofperiodontal healthy subjects by measurement of volatilesulfur compounds in mouth air[J].Arch oral biol,2013,(58):324-330.

[19] 周琳,徐欢,杨成,等.不对称重组酶介导扩增结合分子信标检测金黄色葡萄球菌方法的建立与应用[J].中华检验医学杂志,2017,40(4):309-313.

[20] 王小红,董晨明,杨朝晖,等.多重聚合酶链反应检测呼吸机相关性气管-支气管炎和肺炎患者常见致病菌的研究[J].中国危重病急救医学,2012,24(7):423-426.

[21] 阮艳秋,陈志远.酶标仪双波长和单波长检测技术分析[J].西部医学,2008,20(1):180-183.

[22] 程兴群,徐欣,周学东,等.口腔微生物与肠道微生物的关系[J].华西口腔医学杂志,2017,35(3):322-327.

[23] 徐屹,李雪,黄萍.龈下牙周微生物检测技术的进展状况[J].国外医学(口腔医学分册),2004,31(6):435-437.

R-33 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616(2017)22-23-05

江苏省盐城市医学科技发展计划项目(YK2016051);江苏省高校quot;青蓝工程quot;(苏教师[2016]15号);江苏省青年医学人才(QNRC2016805).

▲通讯作者

2017-09-21)