马宁宁，谢春花，游滢滢，张爽，宋洋

（天津师范大学生命科学学院天津市动植物抗性重点实验室，天津300387）

多效唑对平菇生理生化及动态残留的影响

马宁宁，谢春花，游滢滢，张爽，宋洋*

（天津师范大学生命科学学院天津市动植物抗性重点实验室，天津300387）

多效唑是一种生长调节剂也是杀菌剂，其在菌菇中的限量标准并不明确。研究喷施不同浓度多效唑50、100、150、200、250、300 μg/mL对采后10 d内平菇子实体中多效唑的动态残留情况以及其对子实体的失重率、蛋白质含量、可溶性糖含量、丙二醛含量、超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）和过氧化物酶（Peroxidase，POD）酶活性的影响。结果表明，在平菇施加50 μg/mL多效唑，采后2 d的残留量会降解至0.5 μg/mL（MRL）以下；施加150 μg/mL的多效唑，采后5 d后残留量会低于最高限量残留（maximum residue limit，MRL）；同时，较高浓度的多效唑（150、200 μg/mL）对降低失重、维持营养和保护酶等生理指标的稳定，具有一定的作用。综上所述，多效唑在平菇中的建议使用浓度不超过150 μg/mL。

多效唑；平菇；生理生化；动态残留

平菇（Pleurotus ostreatus）富含蛋白质、维生素、氨基酸等营养成分[1]，是一种人工大面积栽培的食用菌，新鲜的菇体的含水量可以达到90%，在菌体的表面没有显著的保护结构[2]，不便于采后保存，故采摘后常温保存时间为2 d～3 d，货架期非常短[3-4]。因此，应加强对菌菇保鲜技术的开发，延长货架期。

多效唑，又称氯丁唑，是一种常见的植物生长调节剂，低毒无致畸、致癌、致突变作用[5]，大鼠两代繁殖的毒性最大的无作用剂量是41.4 mg/（kg·d）[6]，人体每日允许的摄入量（acceptable daily intake，ADI）为0.1 mg/kg[7]，容易被植物吸收，可以抑制植物生长，提高叶绿素含量，促进根的形成[8]，同时可促进形成花芽，坐果等[9]，在农业中的应用在于它对作物生长的控制效应。研究发现，多效唑可调节农产品的生长速率，影响农产品生理生化过程。2017年，苏昭柏等[10]通过研究不同浓度多效唑对秧苗素质的影响发现100 μg/mL的多效唑溶液浸种可以控制苗高、提高秧苗素质，张磊等[11]发现喷施多效唑可以提高小豆籽粒的可溶性糖和淀粉总量，达到增产的目的；2016年，殷文涛等[12]研究了不同浓度多效唑处理对西瓜幼苗生长生理的影响表明在西瓜种子萌芽期喷施5 μg/mL的多效唑、子叶微展期喷施10 μg/mL的多效唑均可降低植株高度、提高叶绿素含量和根系活力，吴娟等[13]研究不同浓度多效唑对板栗的影响发现多效唑浓度为300 μg/mL时保护酶活性最高、植株抗逆性最强。多效唑作为生长抑制剂目前美国只允许在草坪草上使用，欧盟允许其在苹果和梨上使用。目前中国、欧盟、日本、澳大利亚等制定了多效唑在水果、蔬菜、粮食和油料等多种作物中的最大残留限量值[14]，其中我国规定荔枝、稻谷、小麦、苹果、菜籽油、花生仁中多效唑的限量残留是0.5 μg/mL，油料中为 0.2 μg/mL[15]，虽然多效唑在中国登记的作物不包括食用菌，也未制定其相关最大残留限量，据杂志报道[16]，多效唑已被应用于部分食用菌。本试验拟通过研究采后施加不同浓度多效唑对平菇的生理生化影响及在平菇子实体中的残留动态结果分析，对多效唑对采后平菇的生理生化影响以及合理喷施浓度进行分析判断，为多效唑在平菇采后的应用提供理论支撑，为多效唑在其他食用菌中的应用研究提供科学依据，为食用菌中多效唑残留限量标准的建立提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

平菇：新鲜平菇，采摘于天津市农业科学院林果所。采后立即运回天津师范大学生命科学学院，清理，4℃保存。

甲醇（国产色谱纯）：天津市化学试剂供销公司；乙腈：美国赛默飞世尔科技有限公司；SPE固相萃取柱（1 000 mg，6 mL）：美国塞分科技有限公司；多效唑的标准品（99%）：山东省西亚化学工业有限公司。

1.2 仪器与设备

Waters Alliance 2695高效液相色谱仪：美国Waters公司；固相萃取仪：天津市奥特赛恩斯仪器有限公司；紫外分光光度计（Lambda 35）：美国Perkin Elmer公司。

1.3 多效唑残留量的测定

1.3.1 溶液配制

标准溶液：精确称取多效唑标准品质量0.005 0 g（精确至0.000 1 g），甲醇溶液溶解定容稀释至浓度为0.20、0.50、1.00、2.00、5.00、10.00 μg/mL，过 0.22 μm 滤膜，待用。

施用多效唑溶液：称取多效唑标准品，少量甲醇溶液溶解，用水稀释到 50、100、150、200、250、300μg/mL，每个浓度的溶液200 mL。

1.3.2 色谱条件

流速是1 mL/min；温度为40℃；波长是220 nm；进样量为20 μL；色谱柱为XBridge C18色谱柱；流动相是乙腈∶水=1∶1（体积比）。

1.3.3 样品处理

称已经粉碎好的平菇子实体样品5.00 g，加入乙腈溶液10 mL，涡旋，加入NaCl 1.50 g静置10 min涡旋后8 000 r/min，10 min离心，取上清液备用。然后用5 mL甲醇和5 mL水预处理固相萃取柱，取上清液过柱，再用5 mL水和5 mL 5%甲醇淋洗萃取柱，弃去淋洗液，抽干小柱，5 mL甲醇洗脱小柱，收集洗脱液，过0.22 μm滤膜，待测。

1.4 生理指标测定方法

失重率测定：失重率/%=（菇体初始时的质量-菇体测定时的质量）/菇体初始时的质量×100。

蛋白质含量测定：考马斯亮蓝法测定蛋白质含量。

可溶性糖、丙二醛含量测定：《植物生理实验指导》第四版——丙二醛的测定。

SOD酶活性测定：《植物生理实验指导》第四版——超氧化物岐化酶活性的测定：比色法。

POD酶活性测定：《植物生理实验指导》第四版——过氧化物酶活性的测定（Ⅱ）：比色法。

1.5 处理方法

试验设置6个处理，在平菇采摘前1天喷施已配制好的施用多效唑溶液，对照用蒸馏水，采摘时每个处理平菇采摘质量为3.00 kg，4℃密封（LDPE保鲜自封袋，400 mm×250 mm×0.020 mm）保存。

在喷施药品并风干后 2 h、2 d、5 d、8 d、10 d 测定平菇样品的多效唑的残留情况和失重率等生理生化指标。

2 结果与分析

2.1 多效唑在平菇中的动态残留

本试验通过对提取方法、净化方法、色谱条件的优化，最终确定的试验条件是乙腈提取，SPE固相萃取柱萃取净化。液相色谱检测时检测条件为流动相是乙腈∶水=1∶1（体积比），检测波长为220nm，柱温是40℃。

2.1.1 标准曲线和检出限

结果表明，在 0.20 μg/mL～10.00 μg/mL 浓度范围内多效唑的质量浓度与对应的峰面积呈现良好的线性范围，其回归曲线方程是y=48 693x+298.17，R2=0.999 7，测得方法的检出限为0.005 μg/mL。标准曲线见图1。

图1 标准曲线Fig.1 Standard curve line

2.1.2 样品测定

本试验对平菇子实体喷施的不同浓度多效唑（0～300 μg/mL）在10 d内的动态残留变化进行分析。根据我国规定多效唑在果蔬中的最高残留限量标准（MRL）为0.5 μg/mL，不同浓度多效唑在平菇子实体中的残留见表1。

表1 不同浓度多效唑在平菇子实体中残留情况Table 1 Residual situation of different concentrations of paclobutrazol in Pleurotus ostreatus

由表1结果可以看出，喷施多效唑两天，除50μg/mL喷施浓度外，其它喷施浓度的子实体残留量均超过MRL。随着时间变化，多效唑动态残留趋势是逐渐下降的，这与多效唑在平菇子实体中的降解有关。多效唑浓度低于150 μg/mL时5 d～10 d后残留量均低于MRL；喷施浓度大于150 μg/mL时，残留量始终高于MRL，且其降解程度逐渐减小。这是由于高浓度的多效唑对子实体生长代谢产生了抑制作用，阻碍了菌丝体对多效唑的降解过程。

不同浓度多效唑处理在平菇子实体中残留量差异显著性结果表明，各组处理间多效唑残留量差异均极显著，这说明多效唑在平菇子实体中的残留情况与喷施浓度有关，随多效唑喷施浓度的增加，其残留量变化情况是先上升后下降的。多效唑可以影响细胞内SOD等酶的活性和脱落酸、赤霉素等激素的含量，同时也会影响细胞质膜的稳定性[17]，过高浓度的多效唑会破坏子实体的细胞稳定性，造成子实体吸收多效唑的能力下降，故多效唑使用量过高时，其残留量会下降。

2.2 不同浓度的多效唑对平菇失重率的影响

采后平菇的质量损失包括水分损失和呼吸损失，失重率是菇体采后品质变化的重要指标之一，不同浓度多效唑处理下平菇子实体失重率变化见表2。

表2 不同浓度多效唑对平菇子实体失重率的影响Table 2 Effects of different concentrations of paclobutrazol on the weight loss rate of Pleurotus ostreatus

由表2可知，平菇子实体失重率随贮藏时间的增加而增加。在整个贮藏期内，所有处理组的菇体失重率与对照组相比差异均极显著（P＜0.01），多效唑施用浓度的越高子实体的失重率越小，且150、200 μg/mL多效唑浓度处理的平菇子实体失重率的变化最小，差异不显著（P＞0.05），而 250、300 μg/mL 多效唑浓度处理的平菇子实体失重率与150、200 μg/mL多效唑浓度处理组相比差异极显著。

2.3 不同浓度的多效唑对平菇中可溶性糖含量的影响

糖类是生物体中主要的供能物质，生物体中糖类含量的高低反映出生物体代谢活动的强弱。多效唑对平菇子实体可溶性糖含量的影响见表3。

表3 多效唑对平菇子实体可溶性糖含量的影响Table 3 Effect of Paclobutrazol on Soluble Sugar Content of Pleurotus ostreatus

由表3可知，贮藏时间越长平菇子实体中可溶性糖含量越低；随着喷施多效唑浓度的增加，平菇子实体中可溶性糖含量的下降趋势有所缓解，且多效唑浓度越高，可溶性糖含量的变化越小，且多效唑浓度为250 μg/mL和300 μg/mL时，可溶性糖含量变化极小。由此可知，多效唑可以缓解采后平菇中可溶性糖的分解，保持子实体的品质和质量。

2.4 不同浓度的多效唑对平菇中丙二醛含量的影响

丙二醛含量的高低表示细胞的膜脂过氧化的程度以及细胞对逆境条件的反应程度。多效唑对平菇子实体中丙二醛变化的影响见表4。

表4 多效唑对平菇子实体中丙二醛变化的影响Table 4 Effect of paclobutrazol on the content of malondialdehyde in Pleurotus ostreatus

由表4看出，喷施多效唑溶液可以调节平菇子实体中丙二醛的产生。试验结果表明，与对照组相比，喷施多效唑溶液的平菇子使体内丙二醛增量变缓，且浓度低于200 μg/mL时，多效唑浓度越高，其丙二醛含量变化量随之减小，而多效唑浓度高于200 μg/mL时，子实体内丙二醛含量的变化量不再随多效唑喷施浓度的增加而减少。说明多效唑处理可以提高子实体的抗逆性，减少子实体内丙二醛的含量。

2.5 不同浓度的多效唑对平菇中蛋白质含量的影响

平菇的生长发育和采后成熟衰老的过程中，蛋白质总量的变化与平菇组织的生理生化过程密切相关。多效唑对平菇子实体蛋白质总量的影响见表5。

表5 不同浓度多效唑对平菇蛋白质含量的影响Table 5 Effects of different concentrations of paclobutrazol on protein content of Pleurotus ostreatus

由表5可知，随着贮藏时间的增加平菇中蛋白质含量是逐渐减少的，随着多效唑喷施浓度的增加平菇中蛋白质含量的变化趋势变缓，且在整个贮藏期内，所有处理组的菇体蛋白质含量与对照组相比差异均极显著（P＜0.01），其他组相比多效唑浓度为250 μg/mL和300 μg/mL时，平菇子实体中蛋白质含量的变化量极小。由此可知，多效唑可以减缓平菇中蛋白质含量的降低，保持平菇品质。

2.6 不同浓度的多效唑对平菇中SOD、POD酶活性的影响

SOD对氧自由基有强烈清除作用，维持活性氧代谢平衡。多效唑对平菇子实体SOD酶活性的影响见表6。

表6 不同浓度多效唑对平菇SOD酶活性的影响Table 6 Effects of different concentrations of paclobutrazol on SOD activity of Pleurotus ostreatus

测定结果见表6，平菇子实体中SOD酶活性随贮藏时间的增加呈现先上升后下降的趋势，但酶活性峰值出现时间由于多效唑的使用发生改变。与对照相比，除多效唑浓度为250、300 μg/mL外，随多效唑喷施浓度的增加，平菇SOD酶活性峰值出现时间随之推迟，并且最终SOD酶活性与对照组相比差异均极显著（P＜0.01），其中多效唑浓度为 150 μg/mL 和 200 μg/mL时，其酶活性峰值出现时间最晚，最终酶活性较高，二者差异性不显著（P＞0.05）。

POD可分解氧化氢分解，避免过氧化氢对生物有机体的毒害作用。菇体中的POD酶活性越强，菇体的抗逆性就越强。多效唑对平菇子实体POD酶活性的影响见表7。

表7 多效唑对平菇子实体POD酶活性的影响Table 7 Effect of paclobutrazol on POD activity of Pleurotus ostreatus

测定结果如表7，随贮藏时间的增加平菇子实体中POD酶活性呈先上升后下降的趋势。除多效唑浓度为300 μg/mL外，试验组中平菇子实体最终POD酶活性极显著（P<0.01）高于对照组。除多效唑浓度为250、300μg/mL外，处理组中平菇子实体POD酶活性的峰值出现时间均为第5天，对照组峰值出现时间为第2天。

3 结论

通过多效唑动态残留结果分析，喷施多效唑的浓度低于150 μg/mL时，平菇子实体中多效唑在第10天时的残留量低于MRL，多效唑浓度高于150 μg/mL时，多效唑残留量均高于MRL，且动态残留趋势发生改变，其原因与多效唑不仅是一种生长抑制剂还是一种杀菌剂有关，过高浓度的多效唑会破坏对平菇菌丝体结构的稳定性，从而影响其代谢过程对平菇子实体的生长代谢产生抑制作用。在多效唑对平菇采后生理生化影响的研究中发现，平菇采前1天喷施150 μg/mL和200 μg/mL的多效唑溶液可以抑制平菇的自身代谢过程，减缓水分的损失，延缓平菇的衰老，延长其保存时间，增加平菇的经济价值；多效唑使用浓度为250 μg/mL和300 μg/mL时，平菇子实体的失重率、蛋白质含量、可溶性糖含量、丙二醛含量以及酶活性变化趋势均发生改变，其原因是过高浓度的多效唑会破坏平菇的菌丝稳态，抑制其正常生长代谢，这与多效唑动态残留研究试验所得结论一致。综合以上结果，建议平菇中使用多效唑的浓度应不超过150 μg/mL。

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Effects of Paclobutrazol on Physiological，Biochemical and Dynamic Residues of Pleurotus Ostreatus

MA Ning-ning，XIE Chun-hua，YOU Ying-ying，ZHANG Shuang，SONG Yang*
（Tianjin Key Laboratory of Animal and Plant Resistance，College of Life Sciences，Tianjin Normal University，Tianjin 300387，China）

Paclobutrazole was a growth regulator and a fungicide，and its limited standard in bacteria was not clear.The effects of different concentrations of paclobutrazol 50，100，150，200，200，300 μg/mL on the dynamic residues and physiological and biochemical effects of paclobutil in Pleurotus ostreatus were investigated.The physiological and biochemical indexes included the weight loss rate of the fruiting body Content，soluble sugar content，malondialdehyde content，superoxide dismutase（SOD）and peroxidase（POD）enzyme activity.The results showed that 50 μg/mL paclobutrazol was applied to Pleurotus ostreatus and the residual amount was reduced to 0.5 μg/mL（MRL）after 2 days.Apply 150 μg/mL of paclobutrazol，residues were lower than the maxi mum residue after 5 days.At the same time，higher concentrationsof paclobutrazol （150 μg/mL and 200 μg/mL）had a certain effect on reducing the stability of physiological factors such as weight loss，maintenance nutrition and protective enzymes.In view of the above，paclobutrazol in Pleurotus ostreatus recommended concentration of not more than 150 μg/mL.

paclobutrazol；Pleurotus ostreatus；physiology and biochemistry；dynamic residue

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.23.037

国家自然科学基金青年科学基金项目（31301487）；天津市科技计划项目（13JCQNJC14800）；天津市科技计划项目（14ZCDGNC00098）

马宁宁（1993—），女（汉），硕士研究生，研究方向：食品安全与检测。

*通信作者：宋洋（1983—），女（汉），讲师，博士，研究方向：食品安全与检测。

2017-08-21