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(北京市农林科学院玉米研究中心/玉米 DNA 指纹及分子育种北京市重点实验室, 北京 100097)

我国玉米地方种质的单倍体诱导和加倍特性研究

段民孝，刘新香，张华生，宋伟，王元东，邢锦丰，张雪原，张春原，赵久然

(北京市农林科学院玉米研究中心/玉米 DNA 指纹及分子育种北京市重点实验室, 北京 100097)

双单倍体(doubled haploid,DH) 育种技术具有加速育种进程的突出优势,已成为玉米育种关键性核心技术并在国外广泛应用。本试验选用47份玉米地方种质，进行单倍体诱导和单倍体加倍特性研究。结果表明，47份玉米地方种质材料之间杂交诱导的拟单倍体率有显著差异，介于1.64%～14.50%之间，平均为5.95%。种植12份玉米地方种质的拟单倍体籽粒进行田间鉴定，标记鉴定准确率介于40.2%～82.3%之间，校正单倍体诱导率介于2.33%～6.45%之间，表明玉米遗传背景影响到籽粒标记的表达，单倍体诱导率有明显差异。将15份玉米地方种质拟单倍体于冬季在海南田间种植，加倍授粉株率介于2.7%～27.2%之间，加倍结实株率介于0.7%～8.9%。说明我国玉米地方种质的遗传多样性丰富，单倍体诱导率和加倍率具有明显差异,利用DH 育种技术可以拓宽和加强我国玉米地方种质在玉米育种中的利用。

玉米； 地方种质； 单倍体； 诱导； 单倍体加倍

玉米是世界重要的粮食、饲料和工业原料，同时也是重要的能源作物。据预测，到2050 年，全球范围内谷物产量增加56%以上才能满足将来的社会需要，而增加部分的45%将依靠玉米产量的提高[1]。在我国，单产水平的提高对玉米总产增加的贡献率超过60%，其中，品种改良对玉米单产增长的贡献率为35% ～40%[2]。采用常规育种方法选育品种，周期长，效率低，财力物力人力花费很大。通过诱导获得单倍体，进行单倍体染色体加倍，只需2个世代就可以获得纯系(Double Haploid，称为DH系)，缩短自交系选育年限，加速了品种改良的进程，已经广泛用于育种和研究的多个领域[3-4]。DH技术被认为是玉米育种历程中继杂交技术、加代繁育之后第三大最重要方法创新[5]。单倍体的诱导和加倍是玉米单倍体技术中的2个中心环节，而限制单倍体技术在商业育种中规模化应用的主要因素有诱导系的诱导效率、单倍体的筛选效率和单倍体的加倍效率。研究表明，同一诱导系对不同的基础材料诱导率存在差异性，不同母本材料对单倍体的诱导率有显著影响[5]，同一基础材料诱导产生的单倍体在不同生态型条件下的单倍体诱导率存在显著差异[6]。

玉米在我国已有500 多年的种植历史，在复杂的地理环境、气候条件和多样化的栽培措施等多重因素影响下，逐步形成了多样性的种质资源[7]。在热带资源[8-9]、甜玉米[10]、糯玉米[11]开展利用DH 育种方法研究，表明不同种质资源[12-13]的单倍体诱导率和加倍率差异明显。目前还没有在地方种质中开展DH 育种研究的相关报道。本试验选用47份玉米地方种质进行单倍体诱导和单倍体加倍研究，为地方种质开展DH 育种提供参考。

1 材料与方法

1.1 材 料

试验使用受体材料由中国农科院作物科学所王天宇研究员提供的47份玉米地方种质(见表 1)。玉米单倍体诱导系选用北京市农林科学院玉米研究中心选育的京科诱045、从中国农业大学引进的玉米单倍体诱导系CAU 5以及由两者组配的杂交种JKY 2，均具有籽粒Navajo标记[5]。

1.2 方 法

试验在北京市昌平区北京市农林科学院玉米研究中心小汤山试验基地进行。2015年5月27种植试验受体，每一个受体材料种子250粒全部种植4行，行长10 m，行距60 cm 。为调节散粉吐丝花期相遇，玉米单倍体诱导系分别于2015年6月5日、6月10日错期种植。受体出苗后，个别间苗，保留多数植株。母本在散粉前全部去雄，以便提高授粉纯度，完熟期收获。田间管理同一般大田。诱导杂交果穗收获后，依据籽粒Navajo标记进行单倍体鉴别，籽粒顶部具有紫色即为杂交籽粒数，其中顶部为紫色、胚部无色的子粒视为拟单倍体籽粒[5]。

将获得拟单倍体籽粒数量较多的15份地方种质材料于 2015年11月1日在北京市农林科学院海南南滨农场玉米南繁育种基地单粒种植，精细管理。在苗期依据植株生长势、株型以及紫色植株标记进行进一步鉴定，拔节后，植株生长势强、植株高大、叶片宽大、株型披散、茎干或叶片出现紫色的植株均为杂合植株，全部去除，保留生长发育慢、植株较矮、叶片上冲、叶色较浅的单倍体植株。抽雄后，及时用授粉纸袋将植雌穗套住，每天调查雄穗的花药显露和花粉散落情况，将花粉自然散落的植株进行自交，而对于花药小、散粉不正常的植株用小刀将花药对横向切开后再授予雌穗花丝，完成自交。将授粉植株进行标记。授粉后，调查单倍体成株的株数，授粉自交的单倍体植株数。成熟后，统计收获雌穗结实的植株数，收获的果穗为DH系。

1.3 统计项目

拟单倍体率(%)=拟单倍体籽粒数/杂交籽粒数×100%；

标记鉴定准确率(%)=(拟单倍体籽粒数-去除杂株数)/拟单倍体籽粒数×100%；

校正单倍体诱导率(%)=(拟单倍体籽粒数-去除杂株数)/杂交籽粒数×100%；

授粉株率(%)=授粉株数/单倍体成株数×100%；

加倍结实株率(%) =收获 DH 系植株数/单倍体成株数×100%。

1.4 数据处理

利用 Microsoft Excel 2007 进行数据处理和统计分析。

2 结果与分析

2.1 玉米地方种质的单倍体诱导率差异性

2015年8月北京出现大风，部分试验材料倒伏严重，影响到授粉杂交工作，得到的杂交诱导果穗数量不等。杂交诱导籽粒数最少为844粒，最多为17 393粒。获得拟单倍体籽粒最少为30粒，最多为1 914粒，拟单倍体率最低为1.64%，最高为14.50%。合计获得杂交籽粒406 477粒，拟单倍体籽粒24 188粒，平均诱导率为5.95%。将数据分布做出散点图(如图1)，由图1可以看出，47份玉米地方种质的拟单倍体率主要分布在2%～8%之间，其中17个材料的拟单倍体率在4%～6%之间，而2%～4%、6%～8%之间分别有10、14个材料。

2.2 玉米地方种质的单倍体籽粒标记鉴定准确率和校正后单倍体诱导率

2015年冬季种植的15份玉米地方种质材料的单倍体籽粒校正诱导率和籽粒标记鉴定准确率结果列入表2。由表2可以看出，1号材料拟单倍体籽粒出苗率最低(为58.9%)，其余均超过60%，32号材料出苗率最高(为90.9%)，说明玉米单倍体籽粒不能全部发芽出苗。本研究中，用拟单倍体籽粒数减去杂合植株数来估计真正单倍体籽粒数，这种统计前提是假设杂合籽粒全部发芽。杂合植株杂合籽粒更容易出苗，植株生长势强，生长较快，植株相应高大，株型披散，拔节后株高差异增加，此时更容易淘汰杂合植株。不同材料遗传背景影响到籽粒Navajo标记表达程度，因此影响籽粒标记鉴定准确度。2份材料的籽粒标记鉴定准确率偏低，分别为40.2%、45.7%，其余均超过60%以上，7个材料的籽粒标记鉴定准确率在60%～70%之间，2个材料的籽粒标记鉴定准确率在70%～80%之间，4个材料的籽粒标记鉴定准确率超过80%，最高为82.3%。

表1 试验选用地方种质材料编号与拟单倍体率结果

材料编号中期库位统一编号品种名称 杂交果穗数拟单倍体籽粒数杂交籽粒数拟单倍体率1ZLG0699800010003 小白磁11452870227．522ZLG0023600010005 大洋白玉米122983131967．453ZLG0699900010009 海粒黄70306105622．904ZLG0462400010017 建明白7534496393．575ZLG0462600010019 大灯笼红3113139443．326ZLG0700100010035 火棒子5117440394．317ZLG0700200010063 海里黄103784124026．328ZLG0700300010065 黄洋玉米4951366987．669ZLG0700500010070 白玉米籽白7925761194．2010ZLG0464000010071 白马牙109446107434．1511ZLG0700600010072 早熟黄8366091937．1812ZLG0700700010078 二把粗黄玉米4415146543．2413ZLG0023700010113 BGC171289100032．8914ZLG0700800010117 大兴黄237014514．8215ZLG0023800010118 高油玉米851018162006．2816ZLG0700900010119 高油综合种1131527173938．7817ZLG0023900010120 Na1110H20c46447185535．5118ZLG0701100020004 蓟县白马牙7048067867．0719ZLG0701200020008 宝坻金皇后30367365910．0320ZLG0701300020013 小粒黄68996701914．1921ZLG0701400020016 快红挺6332363275．1122ZLG0701500020018 大粒黄5739778005．0923ZLG0701600020019 塌顶黄4641468176．0724ZLG0701700020020 军粮城白马牙6627075553．5725ZLG0701800020021 小御河7945080325．6026ZLG0701900020022 平谷白99459111414．1227ZLG0702000020023 双桥白4917528626．1128ZLG0702100020024 小八趟96588103825．6629ZLG0702200020025 大屁股快130736131755．5930ZLG0702300020026 黄硬粒7626460684．3531ZLG0702400020027 白马牙4234146977．2632ZLG0702500020028 白玉米88778134075．8033ZLG0702600020029 灯笼红9717511688410．3734ZLG0702700020030 黄马牙8519141320014．5035ZLG0702800020032 黄玉顶91253153921．6436ZLG0702900020033 六十日还家82596102335．8237ZLG0703000020034 黄粒子3419031486．0438ZLG0703300030011 张市二白子92720116226．2039ZLG0703500030043 红棒子94331106283．1140ZLG0703600030045 二黄棒子13308443．5541ZLG0703800030058 白刺棒子8030783443．6842ZLG0704000030108 迁安白马牙7749689485．5443ZLG0704100030128 洋黄102359125902．8544ZLG0704200030148 宝莲灯4932753906．0745ZLG0704300030166 安次白马牙7432366884．8346ZLG0704500030235 中熟白玉米6448272666．6347ZLG0704600030241 衡水多穗6141977625．40合计—— —3440241884064775．95(均值)

表2 玉米农家种材料单倍体田间鉴定与自然加倍结果

材料编号播种数(粒)出苗数(株)杂合株数(株)成株单倍体数(株)授粉株数(株)DH数(株)出苗率(%)标记鉴定准确率(%)拟诱导率(%)校正单倍体诱导率(%)授粉株率(%)结实株率(%)1428∗2528514516158．980．17．5—11．00．729836911594631212070．383．87．56．226．14．37784484170312321261．778．36．35．010．33．885134051811855278．964．77．75．02．71．11166048112431227972．981．27．25．88．72．915101878932540057777．568．16．34．314．31．8161098∗9073705261124782．666．38．8—21．38．920996847541290792585．045．714．26．527．28．62858846910433471979．882．35．74．721．32．72973660620634320482．372．05．64．05．81．23277870746525357790．940．25．82．322．52．833175114147006541324480．860．010．46．220．26．7341196∗1021437557471185．463．514．5—8．42．03659644723021922375．061．45．83．610．01．438720582244300542080．866．16．24．118．06．7合计128451010243415293852221——————均值——————77．567．68．04．815．23．7

注：“*”表示不参与分析校正单倍体诱导率。

图1 玉米农家种材料单倍体诱导率分布情况

通过田间鉴定去除杂合植株，对原拟单倍体诱导率进行校正。1号、16号、34号等材料的播种单倍体籽粒数与挑选的拟单倍体籽粒数不符，不参与校正单倍体诱导率分析。在分析的12份种质的校正单倍体率中，20号材料的校正单倍体诱导率比拟单倍体诱导率降低最大为7.7个百分点，33号、32号材料的校正单倍体诱导率差异较高，分别为4.15、3.47以外，其余材料的校正单倍体诱导率比拟单倍体诱导率降低均在1～2个百分点。32号材料的单倍体籽粒标记鉴定准确率最低，其校正单倍体诱导率也最低。

2.3 玉米地方种质的单倍体自然加倍率

在冬季海南种植，15份玉米地方种质材料的单倍体自然加倍率有显著差异。植株雄穗是否显露花药、花药显露植株是否和花丝相遇、花丝是否加倍，都影响到最后植株果穗结实情况。将花药显露、雌雄协调植株进行自交的植株作为授粉株。可以看出，授粉株率最低为8号，仅为2.7%，11号、29号、34号材料的授粉株率也低于10%，其余都达到或超过10%，20号材料授粉株率最高为27.2%。植株显露花药未必有花粉，花丝不一定得到加倍，授粉后植株也不能全部结实，因此最后加倍结实株数减少。15份材料的加倍结实率差异明显，1号材料最低为0.7%，11个材料的加倍结实株率低于5%以上，2个材料加倍结实株率超过8%，最高达到8.9%。

3 结论与讨论

本研究以我国玉米地方种质为材料，利用玉米单倍体诱导系杂交诱导获得单倍体，47份玉米地方种质材料之间的拟单倍体诱导率有显著差异，介于1.64%～14.50%之间，平均为5.95%。其中12份地方种质的拟单倍体经过田间种植进一步鉴定，标记鉴定准确率介于40.2～82.3%之间。诱导率多数降低1～2个百分点，校正单倍体诱导率介于2.33%～6.45%之间。在海南冬季田间种植条件下，15份地方种质的授粉株率介于2.7%～27.2%之间，加倍结实株率介于0.7%～8.9%。表明我国玉米地方种质的遗传多样性丰富，单倍体诱导率和加倍率具有明显差异。

以单倍体诱导系杂交诱导为基础的玉米DH 育种技术是一项有效缩短育种年限，并且能获得遗传背景完全纯合的玉米自交系的关键技术，已经在美国杜邦先锋、孟山都、德国 KWS 等跨国公司的玉米育种中得到大规模的应用[14]。自从第1个孤雌生殖诱导系Stock 6发现以来，后续选育出了ZMS、WS 14、 UH 400、RWS、CAU 5等诱导率和农艺性状都优于Stock 6 的孤雄生殖诱导系，单倍体诱导效率不断提高[4]。被诱导材料的遗传背景也影响到单倍体产生效率。玉米单倍体自然加倍频率极低，而雌穗比雄穗容易加倍，雄穗能否加倍是DH育种体系应用的主要限制因素[4]。单倍体植株是否显露花药、花药大小和是否饱满、雌雄是否协调均影响到最后加倍结实株数。对单倍体进行化学处理可以提高加倍效率，但操作繁琐、药剂毒性大，一定程度上影响了DH 规模工程化应用。诱导系的单倍体诱导效率、单倍体的筛选效率、单倍体加倍为DH系的加倍效率以及DH系鉴定与测配效率，均影响到DH育种的总体效率。

我国多样性的玉米地方资源具有特殊的地方适应性，对我国玉米品种改良发展具有重要作用。应加强玉米地方种质的详细研究，充分挖掘了解不同种质的单倍体诱导和加倍特点，采取针对性有效的手段，提高DH 育种总体效率，为我国玉米种质扩充和加快我国玉米品种改良进程提供有效途径。

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Study on the Induced and Doubled Properties of Maize Landraces in China

DUANMinxiao,LIUXinxiang,ZHANGHuasheng,SONGWei,WANGYuandong,XINGJinfeng,ZHANGXueyuan,ZHANGChunyuan,ZHAOJiuran

(Maize Research Center,Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences,Beijing Key Laboratory of Maize DNA Fingerprinting and Molecular Breeding,Beijing 100097,China)

The doubled haploid(DH) technology has been used widely in maize breeding,due to its advantage of immediate homozygosity to accelerate breeding progress.In this paper,47 Chinese maize landraces were used to study the induced and doubled properties.The result showed that the imitate haploid induction rate(HIR) was 1.64%-14.50% among 47 maize landraces,the average haploid induction rate was 5.95%.After planting and identifying,the corrected HIR were 2.33%-6.45%,the accuracy of kernel marker indentified was 40.2%-82.3% among 12 maize landraces.In winter,15 maize landraces were planted in Hainan province,the pollinated plant rates was 2.7%-27.2%,the doubled plant rates was 0.7%-8.9%.The above result indicated that haploid induction rate and haploid doubled rate was significant among Chinese maize landraces.By applying the DH technology,use of the maize landrace will be broadening and enhancing in maize breeding.

maize; landraces; haploid; induction; haploid doubled

2017-02-26

国家重点研发计划项目(2016 YFD 0102003)；北京市农林科学院青年科研基金“玉米单倍体自然加倍适宜区域的研究”(QNJJ 201418)；北京市农林科学院科技创新能力建设专项“玉米种质资源收集、评价与创新” (KJCX 20170112)。

段民孝(1972—)，男，山西省平顺县人；博士，副研究员，研究方向：玉米遗传育种；E-mail:duanminxiao@126.com。

赵久然，研究员，E-mail:maizezhao @126.com。

10.16590/j.cnki.1001-4705.2017.06.030

S 513

A

1001-4705(2017)06-0030-05