吴星月，姚红丽，王北南，鲍雪银，刘朋飞，刘忠宽，曹卫东，刘晓云

(1.河北省微生物多样性研究与应用重点实验室 河北大学生命科学学院，河北 保定 071002； 2.河北省农林科学院农业资源环境研究所，河北 石家庄 050051； 3.中国农业科学院农业资源与农业区划研究所，北京 100081)

沧州盐碱地紫花苜蓿根际促生细菌的筛选

吴星月1，姚红丽1，王北南1，鲍雪银1，刘朋飞1，刘忠宽2，曹卫东3，刘晓云1

(1.河北省微生物多样性研究与应用重点实验室 河北大学生命科学学院，河北 保定 071002； 2.河北省农林科学院农业资源环境研究所，河北 石家庄 050051； 3.中国农业科学院农业资源与农业区划研究所，北京 100081)

本研究以河北省沧州黄骅市紫花苜蓿(Medicagosativa)为研究对象，对采自黄骅地区常郭乡赵子札村、羊二庄镇张八寨村及旧城镇云庄村等10个地点的紫花苜蓿根际土壤进行细菌分离纯化和培养，获得134株根际细菌。进而将其接种到紫花苜蓿植物种苗，培养60 d后，比较分析了接种不同根际促生菌对植物生长的促生影响，选择了30株促生细菌优良菌株，并且对30株细菌菌株进行了溶磷能力和分泌生长素能力的测定。结果表明，菌株EF2对植物干重增重影响最为显著(Plt;0.05)，其溶解有机磷和无机磷能力也最强；菌株LF13分泌生长素的能力最强，其对株高的影响较为明显。研究最终初步筛选出9株溶磷能力和分泌生长素能力较强并能促进紫花苜蓿显著生长的根际细菌。

根际土壤；溶磷；分泌生长素；株高；干重；优良菌株；筛选

土壤盐碱化是制约农业生产的重要因素，据不完全统计[1]，全球盐碱地面积约为9.5亿hm2,我国盐渍土主要集中分布在西北、华北、东北地区及沿海地区，总面积约为0.36亿hm2，占全国可利用土地面积的4.88%[2]。沧州地处河北省东南部，东临渤海，地势低洼、土质盐碱化、淡水资源较缺乏，是河北省盐碱地面积最大的区域，属典型的滨海盐碱地[3]。盐碱地会导致土壤缺水，故适生植物较少。紫花苜蓿(Medicagosativa)是一类能够耐盐碱的豆科植物，在含盐量0.1%～0.8%的土壤中能良好生长[4-7]。三年生苜蓿的根茬在土壤中大约能存留2.25×104kg·hm-2，能使土壤含氮量增加2.5倍以上，而生长6年的苜蓿其速效磷可增加60%。紫花苜蓿的生长与其根际土壤生活的微生物密切相关,除了与根瘤菌共生固氮外，其根际生活的根际促生细菌也为其提供了一定氮源及其他生长所需要的物质。根际促生细菌的功能多样，具有固氮、解磷及分泌生长素等作用。其固定的氮素可以提高土壤肥力，还可增加土壤有效磷。

当前有关苜蓿根际促生细菌的研究较少，安永辉[8]曾研究过根际促生菌(PGPR)对紫花苜蓿幼苗生长及生理发育的影响，结果显示不同根际促生菌对紫花苜蓿幼苗及茎的生长均有促进作用，且根际促生菌能有效提高紫花苜蓿叶绿素的含量，与对照组相比，提高了30%左右；有研究表明，接种根际促生菌在一定程度上可以缓解植物根系受胁迫程度，促进植物根系及植物整体的生长发育[9]；韩光等[10]研究表明，在苜蓿上接种可以溶磷的根际促生菌不仅可以培肥地力，还能显著提高苜蓿产量；同时苜蓿的株高、鲜重较对照组也分别提高了65.4%和45.2%。其他研究也表明，溶磷的根际促生菌可明显提高苜蓿株高、茎粗、干重、干鲜比和叶茎比等[11]。近年来，根际促生菌作为一种重要的环保微生物菌剂，愈发得到广泛关注，越来越多的人专注于其高效菌株的筛选研究。根际促生菌的固氮、解磷作用及生长素分泌、ACC脱氨酶活性等测定已有较多研究报道[12-17]。因此，植物促生细菌对于植物生长和发育是非常重要的，尤其对于盐碱地这个特殊土壤环境，接种促生细菌E 助于植物对于土壤营养元素的吸收利用，提高植物的生存能力。

鉴于此，开展了对盐碱地紫花苜蓿促生细菌的分离、培养和筛选研究，并进行苜蓿接种试验及体外促生能力测定，初步筛选优良的紫花苜蓿根际促生细菌，以期为促生细菌菌剂的农田接种应用准备生产资料，对实现紫花苜蓿增产，改善土壤环境具有重要的实际生产价值和深远的社会意义。

1 材料与方法

1.1苜蓿品种及土壤来源

苜蓿品种为紫花苜蓿中苜一号(结荚期)土壤采自河北省黄骅市常郭乡赵子札村，羊二庄镇张八寨村，旧城镇云庄村等10个地点的紫花苜蓿根际土壤。土壤相关信息如表1所列。

1.2试验培养基

大豆酪蛋白琼脂培养基(TSA)，R2A琼脂培养基，金氏B培养基，无氮培养基，蒙金娜培养基，PKO培养基。

1.3试验设计

1.3.1根际菌的分离纯化与保存 称取10 g根际土壤样品，用无菌生理盐水制成根际土壤悬浮液，采用10倍梯度稀释法，取10-5、10-6、10-73个梯度分别涂布于大豆酪蛋白琼脂培养基(TSA)、R2A琼脂培养基、金氏B培养基和无氮培养基中[17-18]。28 ℃恒温培养3～5 d，挑取不同形态的菌落接种在相应的斜面培养基上。11个土壤样品均按照这种方法分离根际促生菌。对分离得到的菌株进行纯化，并制成甘油管置于-70 ℃冰箱保存。

1.3.2优良植物根际促生菌的植物接种筛选试验

土壤处理：营养基质的土壤取自河北省黄骅市南大港三分区27队，土壤经过风干，去除砂砾和植物残体，研磨，用孔径大小为1 mm的筛子过筛处理；沙子取自河北大学操场，用孔径大小为1 mm的筛子过筛处理；蛭石购于保定市花鸟鱼虫市场。

按土壤∶沙子∶蛭石为50%∶30%∶20%(质量比)充分混匀基质，用无氮营养液调节基质的含水量，含水量为40%。每个平底试管中装60 g营养基质，121 ℃，30 min间歇灭菌两次。

种子发芽：挑选饱满的紫花苜蓿种子，依次浓硫酸浸泡10 min，无菌水冲洗5～7次， 5%次氯酸浸泡5 min，无菌水冲洗5～7次，消毒种子均匀放置于装有润湿滤纸的无菌培养皿中，28 ℃避光发芽，每隔12 h换加一次无菌水。

表1 紫花苜蓿根际土壤采集信息

注：样地1，河北省黄骅市常郭乡赵子札村；样地2，河北省黄骅市羊二庄镇张八寨村；样地3，河北省黄骅市旧城镇云庄村；样地4，河北省黄骅市羊二庄镇；样地5，河北省黄骅市旧城镇大六间房；样地6，河北省黄骅市羊二庄镇张赵村；样地7，河北省黄骅市南大港三分区27队西；样地8，河北省黄骅市南大港三分区27队东；样地9，河北省黄骅市东庄子；样地10，河北省黄骅市木尔庄。

Note: Sample site 1, ZhaozizhaVillage, Changguo Town, Huanghua City, Hebei Province; Sample site 2, Zhangbazhai Village, Yangerzhuang Town, Huanghua City, Hebei Province; Sample site 3, Yunzhuang Village, Jiucheng Town, Huanghua City, Hebei Province; Sample site 4, Yangerzhuang Town, Huanghua City, Hebei Province; Sample site 5, Daliujianfang Village, Jiucheng Town, Huanghua city, Hebei Province; Sample site 6, Zhangzhao Village, Yangerzhuang Town, Huanghua City, Hebei Province; Sample site 7, 27 Sub-village, Sanfenqu Village, Nandagang Town, Huanghua City, Hebei Province; Sample site 8, 27 Sub-village, Sanfenqu Village, Nandagang Town, Huanghua City, Hebei Province; Sample site 9, Dongzhuangzi Village, Huanghua City, Hebei Province; Sample site 10, Muerzhuang Village, Huanghua City, Hebei Province.

菌株培养：供试菌株为分离自无氮培养基的134株菌。将供试菌株接种于R2A斜面上活化后转接至R2A培养液中扩大培养至对数生长期，通过光学显微镜观察确定无杂菌污染。

接种与培养：待种子吸水涨破，萌发至1.0～1.5 cm时，将其置于相应的菌悬液中浸泡30 min后，转至装有沙子、蛭石、土壤混合物的平底试管中，再加入500 μL菌液于种子周围，以添加等量无菌水为对照，每个处理5个平行。置于光照培养箱(额定光照度为22 000 lx)中培养(25 ℃，100%光照，16 h；16 ℃，0光照，8 h)，定期观察紫花苜蓿生长情况，适时添加无氮营养液，以保证植物生长水分所需。

生长指标观测：培养60 d后，取出植物，观察并统计植物的干重、鲜重、株高等生长指标。

1.3.3苜蓿根际促生菌的体外促生能力研究 通过研究根际菌对紫花苜蓿的促生效果，筛选出30株有显著促生作用的植物根际促生菌，为进一步探讨这些菌株促生机制，利用溶磷圈法和Salkowski比色法分别测定了菌株溶磷能力和分泌植物生长素(IAA)能力[19]。

供试菌株为已筛选出的对紫花苜蓿促生作用显著的30株根际促生菌。

溶磷能力测定：采用溶磷圈法测定待测菌株的溶磷能力。首先将待测菌株活化后，用多点接种法将菌株分别接种到蒙金娜培养基和PKO培养基[20-21]中，28 ℃下培养7 d，根据溶磷透明圈直径(D)与菌落直径(d)的比值大小确定溶磷能力。

生长素分泌能力测定：利用比色法测定供试菌株分泌植物生长素IAA能力。首先将待测菌株活化后，进一步纯化，然后分别接种于盛有15 mL R2A液体培养基和盛有15 mL IAA液体培养基的50 mL发酵管中，置于30 ℃的恒温摇床以180 r·min-1的转速培养。培养3 d后，将菌悬液4 000 r·min-1离心5 min，取100 μL上清液滴置于白色陶瓷板上，加入100 μL Salkowski比色液室温下15 min内观察其颜色变化。设定10、30、50 mg·L-13个IAA浓度作为对照，比较粉红色颜色深度。

1.4数据分析

利用SPSS 20.0软件分别对紫花苜蓿干重和株高进行了单因素方差分析，利用Duncan法对所测数据进行多重比较研究。

2 结果与分析

2.1采集土壤理化性质分析

通过对紫花苜蓿根际土壤的pH、碱解氮、有机质、速效磷、速效钾及总盐量的测定，可以得出(表1)：土壤pH为7.57～7.78，属于偏碱性土壤；碱解氮含量的数值变化在19.71～46.31 mg·kg-1，氮素供应能力处于较低等级；有机质含量为10.78～25.83 mg·kg-1，属于中低级水平；速效磷含量在1.71～30.31 mg·kg-1。当土壤速效磷≤10 mg·kg-1时，土壤供磷水平为低级，在10～20 mg·kg-1时，土壤供磷水平为中级，土壤速效磷≥20 mg·kg-1时，土壤供磷水平为高级；速效钾含量变化范围在70.07～203.14 mg·kg-1，土壤中速效钾含量处于较高等级；土壤总盐量在20.00～63.00 mg·kg-1，属于非盐渍土。以上评定结果均参照国标得出[6]。

2.2植物接种试验筛选优良植物根际促生菌结果与分析

将分离菌株分别接种至紫花苜蓿种苗，培养60 d后测试植物生长性状。发现接种134株根际菌的植物的干重和株高均较对照均有所提高，其中有30株根际菌对植物生长有明显促进作用(表2)。

其中，对植物干重影响较为显著(Plt;0.05)的菌株是EF2、IK1，比对照组增加了394.6%和307.7%，菌株LF4、EF1、HT1、CF3次之，较对照组增加了305.9%、304.4%、302.2%、300.2%。对植物株高影响较为显著(Plt;0.05)的菌株为CF3、LF4、IK1，相比对照组分别使株高增加83.2%、82.5%、79.3%，且三者同处于一个统计分析显著性子集。

2.3根际分离菌株的溶磷能力

对30株供试菌株溶解有机磷和无机磷的能力进行测定发现，各菌株在两种培养基上均生长良好，但溶磷能力差异较大。在有机磷蒙金娜培养基上能够产生透明圈的各菌株的平均直径与透明圈直径(表3)，仅有6株可以溶解有机磷，分别为分离自云庄的AF2，分离自羊二庄的EF1、EF2，分离自张八寨的KF2、KF7、KF20。D/d在1.29～2.40，其中溶解有机磷能力较突出的两株菌为EF1和EF2，显著高于其他菌株(Plt;0.05)。而仅EF1和EF2可以溶解无机磷，D/d分别为1.18和1.26，由透明圈的大小可以获知菌株EF1和EF2溶解无机磷的能力较弱(表4)。

2.4根际分离细菌分泌生长素的能力

初步测定了30株供试菌株分泌植物生长素IAA能力，共有7株菌可以分泌IAA(表5)，其中LF13为深粉色，分泌IAA能力较强；BF7和CF4为粉色，分泌IAA能力一般；4株为浅粉色，分泌IAA能力较弱。其中，BF7、CF4、LF13可以在不添加L-色氨酸的R2A液体培养基中分泌IAA，但分泌IAA的能力明显降低。

表2 接种不同根际菌对苜蓿干重和株高的影响

注：同列不同小写字母表示不同处理间差异显著(Plt;0.05)。

Note: Different lowercase letters within the same column indicate significant difference among different treatments of same index at the 0.05 level.

2.5植物根际促生菌对苜蓿促生效果与体外促生能力的综合性分析

综合以上结果可知，对紫花苜蓿生长具有显著促生效果的根际菌，在溶磷能力和分泌IAA能力方面表现出了较大的差异性，菌株EF2对植物干重的影响最为显著(Plt;0.05)，同时该菌株是溶解有机磷和无机磷能力最强的菌株，但不具备分泌IAA能力；菌株LF13分泌IAA能力较强，在干重和株高的表现上优于大部分菌株，但不具备溶解磷的能力；菌株IK1对植物生长的影响较显著，但该菌株既没有溶磷作用，也没有分泌IAA能力，即在本研究中，根际菌溶磷及分泌IAA能力与其对苜蓿的促生效果没有表现出正相关，植物根际促生菌的促生机制有很多种，有些促生能力很强但没有溶磷及分泌IAA能力的菌株可能通过其他方式来促进植物生长，有待进一步深入研究。

表3 部分菌株在蒙金娜培养基上的D/d值(第7天)Table 3 D/d of some strains on Monginamedium (the 7th day)

表4 部分菌株在PKO培养基上的D/d值(第7天)Table 4 D/d of some strains on medium PKO (the 7th day)

表5 供试7株菌株分泌植物生长素(IAA)能力

注：不变色标记为“-”；浅粉色标记为“+”；粉色标记为“++”；深粉色标记为“+++”。

Note: Don’t change color is marked “-”; Light pink is marked “+”; Pink is marked “++”; Deep pink is marked “+++”.

3 讨论与结论

本研究获得了9株能够显著提高紫花苜蓿生长的根际细菌，且其溶磷能力和分泌生长素(IAA)能力也较强，其中菌株EF2对植物干重增重影响最为显著(Plt;0.05)，其溶解有机磷和无机磷能力也最强；菌株LF13分泌生长素的能力最强，其对株高的影响也较为明显。

本研究发现，根际促生菌的溶磷能力、产IAA能力与对苜蓿的促生作用相关性不大。菌株EF2对植物干重增重影响最为显著(Plt;0.05)，同时该菌株是溶解有机磷和无机磷能力最强的菌株，能有效促进植物生长，但该菌株EF2却不具备分泌IAA能力；菌株LF13分泌IAA能力较强，在干重和株高的表现上优于大部分菌株，但该菌株LF13不具备溶解磷的能力；菌株IK1对植物生长的影响较显著(Plt;0.05)，但该菌株既没有溶磷作用，也没有分泌IAA能力，同样地，如KF12、KF19、HF10等菌株，对植物具有显著促生效果，却没有分泌IAA能力及溶磷能力。而无论是具有溶磷能力的菌株或是产IAA能力的菌株，它们均对植物具有促生作用，李春俭和张福锁[23]曾报道用产IAA的促生细菌接种西瓜(Citrulluslanatus)和甜瓜(Cucumismelo)等作物，可以明显增加作物产量，而在黄静等[24]研究发现分离自油菜(Brassicanapus)和玉米(Zeamays)体内的溶磷细菌可以与植物形成互惠互利的关系。那些不具备产生IAA或溶磷能力的菌株可能具有其他促生作用。

研究发现，植物根际促生菌菌株大部分具有固氮、溶磷、释钾、产生植物激素、分泌抗生素等能力[10,20,25-29]。因此，不具备溶磷和产IAA能力的菌株KF12/KF19/HF10等，它们可能是通过其他途径，如固氮或释钾等来实现对植物的促生作用。有研究表明一些促生细菌能够分泌2-酮基葡萄糖、乳酸、苹果酸和蚁酸等，用以溶解磷酸三钙和岩石中的磷，这其中包括无机磷和有机磷[30]。所以在筛选植物根际促生菌时，应综合各方面考虑，不能仅凭植物根际促生菌的一种或两种体外促生能力就能确定其对植物实际生长的影响。本研究认为今后在筛选植物根际促生菌的过程中，应结合菌株对植物的实际促生效果进行综合分析，不能依据单一性状进行高效菌株的筛选。

将根际促生菌引入农业生产，对创造良好的根际生态环境、降低化肥与农药的使用、抑制病虫害的发生有着重要的作用，尽管根际促生菌已得到了广泛的研究，但根际促生菌的应用菌剂尚为缺乏，而且关于其作用机制尚无系统的研究，对其种类的研究也不够充分。因此，对根际促生菌应进行以下三方面的研究：1)加强根际促生菌优良菌株的筛选，并有针对性地选择适合主要农作物生长的根际促生菌，将菌株应用到农业生产，使其发挥重要作用；2)全面开展根际促生菌对植物的促生作用机制的研究，以期发现更多的促生菌株；3)根际促生菌接种剂的研究，研究其对土壤的适应性及在根际的定殖能力。

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(责任编辑 苟燕妮)

Screeningofplantgrowth-promotingbacteriainalfalfagrowninsalineinCangzhou,HebeiProvince

Wu Xing-yue1, Yao Hong-li1, Wang Bei-nan1, Bao Xue-yin1, Liu Peng-fei1, Liu Zhong-kuan2, Cao Wei-dong3, Liu Xiao-yun1

(1.Key Laboratory of Microbial Diversity Research and Application of Hebei Province, College of Life Sciences, Hebei University, Baoding 071002, Hebei, China; 2.Institute of Agricultural Resource and Environment, Hebei Academy of Agriculture and Forestry Sciences, Shijiazhuang 050051, Hebei, China; 3.Institute of Agricultural Resourcesand Regional Planning, Chinese Academy of Agriculture Sciences, Beijing 100081, China)

This study focused onMedicagosativagrowing in Huanghua City, Cangzhou, Hebei Province. Soils adhered toM.sativaroots were sampled from10 different locations in Huanghua City, including Zhaozizha Village in Changguo, Zhangbazhai Village in Yangerzhuang, and Yunzhuang Village in Jiucheng Town. In total, 134 strains were obtained by isolation and cultivation from soil samples. Of these strains, 30 were chosen based on the growth promotion ofM.sativaseedlings after 60 days of incubation. We also compared the performance of the strains based on their phosphate solubilization and auxin secretion abilities. The result showed that the strain EF2 had a significant positive influence on plant dry weight, and it also had the strongest phosphate solubilization ability, whereasthe strain LF13 hadthe strongestinfluenceon plant height, and also had the strongest auxin secretion ability. In conclusion, we obtained nine highly effective strains by investigating the ability of phosphate solubilization and auxin secretion, as well as growth promotion.

rhizosphere soil; dissolved phosphorus; secretion of auxin; plant height; dry weight; effective strains; filter

Liu Xiao-yun E-mail:liuxiaoyunly@126.com

10.11829/j.issn.1001-0629.2017-0005

吴星月,姚红丽,王北南,鲍雪银,刘朋飞,刘忠宽,曹卫东,刘晓云.沧州盐碱地紫花苜蓿根际促生细菌的筛选.草业科学,2017,34(11)：2211-2217.

Wu X Y,Yao H L,Wang B N,Bao X Y,Liu P F,Liu Z K,Cao W D,Liu X Y.Screening of plant growth-promoting bacteria in alfalfa grownin saline in Cangzhou,Hebei Province.Pratacultural Science，2017,34(11)：2211-2217.

S816;S541+.1

A

1001-0629(2017)11-2211-07

2017-01-04接受日期2017-09-26

河北省自然基金——河北沧州耐旱、耐盐碱紫花苜蓿高效根瘤菌及促生细菌的筛选及菌剂的应用研究(C2014201182)；国家农业部公益性行业(农业)科研专项经费项目(201103005-07-06)；河北省生物工程重点学科建设项目(1050-5030023)

吴星月(1993-)，女，河北唐山人，在读硕士生，主要从事根瘤菌蛋白质组学研究。E-mail：847675316@qq.com

刘晓云(1968-)，女，甘肃镇原人，教授，博士，主要从事微生物系统学及应用研究。E-mail：liuxiaoyunly@126.com