杨明非 苏雯 王海英

(北日本制药株式会社产品研发室，日本富山县，930-0314) (广东省珠海市斗门区公立医疗卫生机构管理中心) (东北林业大学)

尿素包合法富集红松子油脂肪酸成分分析

杨明非 苏雯 王海英

(北日本制药株式会社产品研发室，日本富山县，930-0314) (广东省珠海市斗门区公立医疗卫生机构管理中心) (东北林业大学)

采用尿素包合法(液料比为m(脂肪酸)∶V(乙醇)=1 g∶12 mL，m(脂肪酸)∶m(尿素)=1.0∶1.5)，将红松子油中的皮诺敛酸进行富集纯化；利用气相色谱-质谱(GC-MS)分析富集后混合脂肪酸中各个成分质量分数。结果表明：经尿素包合法富集后的混合脂肪酸中，皮诺敛酸(C18∶3)甲酯质量分数最高达到45.8%，其次亚麻酸质量分数为16.32%、亚油酸质量分数4.88%。经纯化富集后的脂肪酸收率虽然较低，但对人体有益的多不饱和脂肪酸质量分数明显增加。

红松子油；皮诺敛酸；脂肪酸；尿素包合法

红松(Pinuskoraiensis)，又名海松、果松、朝鲜松，是松杉纲松科松属植物，主要分布在黑龙江、吉林，辽宁及河北等地[1]。红松松子为红松的种子，脂肪含量丰富，松子中脂肪质量分数在70%左右[2]，含有多种不饱和脂肪酸，其中包括亚麻酸、亚油酸、花生酸、二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸等人体不能合成的脂肪酸；还包括红松子油中特有的皮诺敛酸[3-4]。皮诺敛酸具有降低胆固醇、减肥、升高高密度脂蛋白的功效[5]；有文献提出，补充松油酸能将人肝癌细胞HepG2细胞磷脂酰肌醇部分花生四烯酸的质量分数从15.9%降到8.7%，因此，这种物质有成为研究磷脂酰肌醇基源生物活性脂类功能试验工具的可能性[6-7]。

尿素包合法是常见的分离纯化脂肪酸的方法之一，原理是利用强碱催化水解的方法，即皂化反应，生成脂肪酸盐和甘油，再加入盐酸酸化水解、水洗分离得松子油混合脂肪酸。

尿素是一个四面体的结晶，当它与脂肪酸化合物生成包合物后，包合物呈六面体结晶。尿素分子以螺旋状的方式构成包合物框架，脂肪族化合物被包合在该框架内。饱和脂肪酸较不饱和脂肪酸更容易与尿素形成稳定的包合物，单一双键，较含有两个或更多双键的脂肪酸更容易形成稳定的包合物。尿素分子在结晶过程中，能够与饱和脂肪酸或单不饱和脂肪酸形成较稳定的晶体包合物析出；而多不饱和脂肪酸由于双键较多，碳链弯曲，具有一定的空间构型，不易被尿素包合，采用过滤的方法除去饱和脂肪酸与单不饱和脂肪酸的尿素包合化合物，可以获得较高纯度的多不饱和脂肪酸[8-9]。本实验通过尿素包合法[10]将红松子油中的皮诺敛酸进行富集纯化，并利用气相色谱-质谱联用技术分析富集后混合脂肪酸中各个成分质量分数，为红松子油皮诺敛酸的纯化提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器设备

红松子油，来源于黑龙江宏泰松果有限公司。尿素、95%乙醇、氢氧化钾、盐酸、正己烷、无水硫酸钠等，均为分析纯。甲醇为色谱纯，为天津市科密欧化学试剂有限公司生产。

仪器设备主要为RE-2000A型旋转蒸发仪，巩义市予华仪器有限责任公司生产；7890A-7000B型气相色谱-质谱联用仪，美国Agilent公司生产。

1.2 混合脂肪酸的制备

在20 g松子油中加入50 mL 2% KOH-乙醇溶液，80～90 ℃回流1 h使其水解，蒸干乙醇，冷却后，加入1 mol/L盐酸酸化，调节pH为2～3，用500 mL正己烷萃取3次，除去下层不皂化物。合并正己烷层，用水洗涤直至中性，正己烷层加入20 g无水硫酸钠干燥后，抽滤除去硫酸钠晶体，利用旋转蒸发仪以50 ℃、45 r/min、0.9 MPa条件回收正己烷，制得混合脂肪酸。粗脂肪酸的质量分数=((W-W0)/样品质量)×100%；W为旋转蒸发后反应容器与粗脂肪酸的质量，W0为反应容器的质量。

1.3 皮诺敛酸的甲酯化

尿素包合法[10]富集皮诺敛酸，根据孙宇[9]实验结果确定本次实验脂肪酸尿素比和尿素乙醇比。取混合脂肪酸5 g溶于60 mL乙醇中，然后向脂肪酸醇溶液中加入7.5 g尿素，回流20 min使其混匀，室温冷却。放入冰箱中0 ℃结晶24 h。抽滤，除去晶体后，旋转蒸发除去乙醇，少量盐酸酸化，溶液用125 mL正己烷萃取3次。正己烷层合并后用水中和，无水硫酸钠干燥，抽滤，去除硫酸钠晶体。上述条件下旋转蒸发器除去正己烷，得到富集不饱和脂肪酸。混合脂肪酸收率=(m/m0)×100%；m为尿素包合反应后所得混合脂肪酸的质量，m0为尿素包合反应前所用混合脂肪酸的质量。

1.4 气相色谱-质谱条件

以色谱纯甲醇稀释混合脂肪酸样品取上清液，装入色谱进样瓶，密封。

色谱分析条件：HP-5MS毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；FID检测器；初始温度40 ℃(保持2 min)，以10 ℃/min的升温速率升到280 ℃(保持2 min)；进样口温度250 ℃，进样量1.0 μL；不分流，氦气载气，流速1 mL/min。

质谱分析条件：EI电离源，接口温度280 ℃，离子源温度230 ℃，电子能量70 eV，扫描范围30～500 u。

2 结果与分析

按照公式计算粗脂肪质量分数为66.4%，混合脂肪酸收率为27.3%；富集脂肪酸样品的总离子流色谱图如图1所示，共鉴定出30种化合物，通过面积归一化法计算出各组分的质量分数(见表1)。

图1 富集皮诺敛酸脂肪酸总离子流色谱图

从图1和表1分析可知：皮诺敛酸(C18∶3)甲酯质量分数最高达到45.8%，其次亚麻酸质量分数为16.32%、亚油酸质量分数4.88%、油酸质量分数0.52%。国内外学者对松子油的成分进行分析，朱雪梅等[11]测定松仁油中主要成分包括亚油酸、油酸和松油酸，其中亚油酸质量分数46.29%、油酸质量分数26.68%、松油酸质量分数13.84%。张彧等[6]测定松油酸质量占脂肪酸总质量的第三位，质量分数为14.8%；通过尿素包合法多次包合后，多不饱和脂肪酸收率为11.69%、松油酸质量分数最高可达85.92%。孙宇[9]实验中发现，尿素用量对松油酸富集情况影响较大，在乙醇比例、反应温度、结晶时间等条件不变的情况下，脂肪酸与尿素质量分数在1∶1时，富集后脂肪酸中松油酸质量分数为63.11%、收率为32.69%。Lee et al.[10]的实验中也记载了通过尿素包合法富集后的脂肪酸中，皮诺敛酸的质量分数由原先的14.1%提高到45.1%，皮诺敛酸质量分数提高了3倍左右，饱和脂肪酸棕榈酸结晶后几乎被消除，油酸质量分数也有效降低。刘静波等[3]从冷榨法的红松子油中，鉴定出了棕榈酸、亚油酸、油酸、硬脂酸、二十碳三烯酸、二十碳二烯酸、二十碳烯酸、二十碳酸等8种脂肪酸。常晨等[12]通过GC-MS分析，鉴定出松子油中棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、α-亚麻酸、花生酸等成分的质量分数。

3 结论

气相色谱-质谱(GC-MS)成分分析结果表明：经过尿素包合法(液料比为m(脂肪酸)∶V(乙醇)=1 g∶12 mL，m(脂肪酸)∶m(尿素)=1.0∶1.5)富集后的混合脂肪酸中，皮诺敛酸(C18∶3)甲酯质量分数最高达到45.8%，其次亚麻酸质量分数为16.32%、亚油酸质量分数4.88%、油酸质量分数0.52%。从脂肪酸质量分数可以看出，经本方法纯化富集后的脂肪酸收率虽然较低，但对人体有益的多不饱和脂肪酸质量分数明显增加，大部分饱和脂肪酸以及单不饱和脂肪酸与尿素形成稳定的包合物，从而被过滤析出，多不饱和脂肪酸因其空间构型较大不易形成包合物，得到较高纯度的混合脂肪酸，说明尿素包合法是富集多不饱和脂肪酸的有效方法。

表1 混合脂肪酸GC-MS成分分析结果

[1] 陈宝，南江，王星，等.松子的开发与利用[J].现代农业科技，2010(20)：160.

[2] 董越，刘会平，刘易坤，等.松子油提取工艺及3种松子油脂肪酸组成分析[J].中国油脂，2017，42(4)：8-11.

[3] 刘静波，程婉露，姚志新，等.长白山红松籽油的提取及脂肪酸成分分析[J].食品工业科技，2014，35(6)：239-244.

[4] 李哲敏.松子仁的营养保健功能[J].农牧产品开发，2001(7)：23-24.

[5] 姜莉，赵守成，林颖，等.气相色谱法快速测定松籽油中松油酸的含量[J].现代科学仪器，2004(4)：36-37.

[6] 张彧，李清光，万惠萍，等.尿素包合法富集松油酸的研究[J].食品与机械，2008，24(4)：53-55，64.

[7] TANAKA T， TAKIMOTO T， MORISHIGE J， et al. Nonmethylene-interrupted polyunsaturated fatty acids： effective substitute for arachidonate of phosphatidy linositol[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications，1999，264(3)：683-688.

[8] 吴明一.尿素包合法纯化不饱和脂肪酸的研究[D].天津：天津大学，2007.

[9] 孙宇.松籽油中皮诺敛酸的提取纯化与减肥功能的研究[D].天津：天津科技大学，2009.

[10] LEE J W， LEE K W， LEE S W， et al. Selective increase in pinolenic acid (all-cis-5,9,12-18,3) in Korean pine nut oil by crystallization and its effect on LDL-receptor activity[J]. Lipids，2004，39(4)：383-387.

[11] 朱雪梅，阮霞，胡蒋宁，等.松籽油脂肪酸组成及分布特征分析[J].食品工业科技，2012，33(10)：65-68.

[12] 常晨，阮青俊，包怡红，等.不同山体红松松籽油脂肪酸组成及抗氧化活性[J].东北林业大学学报，2017，45(4)：84-87.

EnrichmentAnalysisofFattyAcidsinPinuskoraiensisSeedOilbyUreaInclusionFractionation//

Yang Mingfei

(Research and Development Department of Kitanihon Pharmaceutical CO., Toyama 9300314, Japan);

Su Wen

(Public Medical Institutions Management Center, Doumen District, Zhuhai, Guangdong Province, P. R. China);

Wang Haiying

(Northeast Forestry University)//

Pinuskoraiensisseed oil； Pinolenic acid； Fatty acid； Urea inclusion fractionation

杨明非，男，1989年10月生，北日本制药株式会社产品研发室，临床医学硕士。E-mail：ymfarcher@163.com。

王海英，东北林业大学林学院，副教授。E-mail：haiyingwang908@126.com。

2017年7月28日。

责任编辑：张 玉。

S789.7

Journal of Northeast Forestry University，2017,45(11)：111-113.

Pinolenic acid inPinuskoraiensisseed oil was enriched and purified by urea inclusion fractionation, liquid material ratiom(fatty acid)∶V(ethanol)=1 g∶12 mL,m(fatty acid)∶m(urea)=1.0∶1.5). The content of each component in the mixed fatty acid was analyzed by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS). Under the optimum conditions, the content of enriched pinolenic acid was increased obviously. The content of pinolenic acid (C18∶3) methyl ester in the mixed fatty acids after enrichment was up to 45.8%, followed by gamolenic acid of 16.32%, 9,12-octadecadienoic acid of 4.88%. The content of fatty acids after enrichment by urea inclusion fractionation is lower, but that of polyunsaturated fatty acids beneficial to the human body is significantly increased.