张 鑫，张 迪，饶艳伟，宋晓斌*

(1.吉林省人民医院 急诊外科,吉林 长春130021;2.长春理工大学医院)

乌司他丁联合顺铂对胃癌细胞凋亡作用的研究

张 鑫1，张 迪2，饶艳伟1，宋晓斌1*

(1.吉林省人民医院 急诊外科,吉林 长春130021;2.长春理工大学医院)

胃癌是胃粘膜上皮的恶性肿瘤，其发病率和死亡率都位于第三位的恶性肿瘤。而且胃癌的发病年龄无局限性，胃癌的发病年龄常见于40-60岁[1]。现阶段胃癌的治疗方法主要是手术切除，之后化疗辅助治疗。顺铂为传统化疗药物，其与DNA交联诱导双链断裂而引起损伤，发挥其毒性作用，应用在胃癌化疗的不同时段，如辅助化疗的ECF方案，姑息化疗的DCF方案和分子靶向治疗的PF+曲妥珠单抗方案，在指南中都被作为Ⅰ类证据推荐临床应用[2]。现有的研究发现顺铂化疗有可能产生耐药，降低了其治疗功效。为了减少顺铂对化疗癌症的耐药性，联合其他药物治疗成为现阶段研究的热点。乌司他丁(UTI)为广谱的蛋白酶抑制剂，可抑制多种水解酶活性(蛋白、脂类、糖类)，具有抗炎、减少细胞和组织损伤、改善微循环和组织灌注等作用。UTI被应用于治疗急性胰腺炎、脓毒症、ALI等，近年来在其抗肿瘤效应中也被很多研究者关注[3]。罗杰的研究证明了抑制乳腺癌细胞的上皮细胞-间质转化，进而影响细胞的侵袭能力的下降[4]。所以，本研究设想联合应用乌司他丁是否增加胃癌细胞系的凋亡作用，进而增加顺铂的化疗效果。所以本研究以胃癌细胞BGC-823为研究对象，加入乌司他丁和顺铂处理细胞后，观察细胞的生存率以及细胞凋亡相关蛋白的表达情况，探讨联合应用乌司他丁是否增加胃癌细胞系的凋亡作用。

1 材料与方法

1.1药品及主要试剂顺铂(美国 Sigma 公司)，乌司他丁(天普生化医药股份有限公司公司)，Cleaved-caspase3蛋白抗体(美国 Abcam公司)，Cleaved-PARP蛋白抗体(美国 Abcam公司)。

1.2细胞培养人胃癌细胞BGC-823由吉林省人民医院中心实验室惠赠。BGC-823采用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培养液，置于37℃，5% CO2的恒温二氧化碳细胞培养箱中培养，并保持一定的湿度。所有细胞均采用0.4%胰酶消化传代培养。当细胞培养24 h后，正常组给予更换培养液；顺铂组给予更换含0.8 μg/ml顺铂培养液；乌司他丁组给予更换含400 U/ml的乌司他丁培养液；顺铂+乌司他丁组为加入0.8 μg/ml顺铂+400 U/ml乌司他丁作用。

1.3MTT法检测胃癌细胞存活率按使用说明书用MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐)法检测细胞生存能力。全自动酶标仪(波长590 nm)测定各孔OD值，计算细胞生存率。

1.4WesternBlot检测胃癌细胞BGC-823中Cleaved-caspase3和Cleaved-PARP蛋白表达提取细胞总蛋白，Bio-Rad 法测定蛋白含量，然后按BCA蛋白定量试剂盒说明书步骤操作，测定样品的蛋白浓度。用ImageJ图像处理软件计算各条豆类灰度值，分析Cleaved-caspase3和Cleaved-PARP蛋白的表达情况。目的蛋白与内参照β-肌动蛋白(β-actin)的灰度值的比值进行描述表达情况。

2 结果

2.1MTT法检测顺铂和乌司他丁处理过的胃癌细胞生存率

MTT结果显示：与正常组相比，顺铂组、乌司他丁组、顺铂+乌司他丁组的细胞生存率明显降低，有显著的统计学意义(Plt;0.01)。与顺铂组和乌司他丁组相比，顺铂+乌司他丁组的细胞生存率明显降低，有显著的统计学意义(Plt;0.01)。见图1。

2.2WesternBlot检测胃癌细胞中Cleaved-caspase3和Cleaved-PARP蛋白表达

与正常组相比，顺铂组、乌司他丁组、顺铂+乌司他丁组的组中Cleaved-caspase3和Cleaved-PARP表达明显增加；与顺铂组和乌司他丁组相比，顺铂+乌司他丁组的凋亡相关蛋白Cleaved-caspase3和Cleaved-PARP明显降低，有显著的统计学意义(Plt;0.01),如图2。

图1 经过顺铂和乌司他丁处理的胃癌细胞BGC-823细胞生存率

图2 Western Blot检测顺铂和乌司他丁处理的胃癌细胞Cleaved-caspase3和Cleaved-PARP蛋白表达

3 讨论

我国的所有癌症中，胃癌的发病率居首位，死亡率高。其治疗方案主要以手术为主，之后予以化疗辅助治疗。在根治性手术的围手术期，常通过化疗延长生存周期。对于病理恶性程度高的胃癌根治术后的患者，瘤体面积大于5 cm的多发性癌灶和根治术后复发的患者通常给予化疗治疗。现在的化疗药物主要为顺铂、氟尿嘧啶、丝裂霉素、紫杉醇、阿霉、草酸铂、拓扑酶抑制剂、希罗达等化疗药物。现有的研究发现顺铂化疗有可能产生耐药，降低了其治疗功效[5]。为了减少顺铂对化疗癌症的耐药性，联合其他药物治疗成为现阶段研究的热点。本研究为了提高顺铂的化疗药物，拟联合乌司他丁对胃癌细胞进行处理。本研究发现，单独应用乌司他丁能降低胃癌细胞的生存率。同时还发现经过乌司他丁处理过的胃癌细胞中凋亡标志性相关蛋白Cleaved-Caspase3和Cleaved-PARP的表达水平明显增加，这说明乌司他丁能增加胃癌的凋亡水平。而乌司他丁被认为是广谱的蛋白酶体抑制剂，对胃癌细胞的作用可能通过对蛋白酶体的抑制作用，影响胃癌细胞中蛋白酶体的降解系统。王云花发现了乌司他丁能明显抑制人结肠癌细胞lovo细胞的增殖和侵袭能力，以及增加了细胞中Caspase3的表达，增加了细胞的凋亡发生[6]。李燕在人绒毛膜癌细胞系中证实了乌司他丁通过抑制uPA的表达降低细胞的侵袭能力[7]。在程伟华的研究中发现了在胃癌组织中uPA表达增加[8]。所以，我们怀疑是不是乌司他丁通过影响细胞内的uPA的表达来改变细胞的凋亡水平，还需要我们的后续试验进一步验证。之后我们将乌司他丁与顺铂联合处理胃癌细胞，发现与单独应用顺铂组相比，联合用药组细胞生存率明显降低，同时通过Western Blot我们还发现了胃癌细胞中Cleaved-Caspase3和Cleaved-PARP蛋白的表达水平明显增加。这说明了联合应用乌司他丁与顺铂能明显增加胃癌细胞的凋亡水平，其具体作用机制还有待于进一步探讨。在现阶段的研究中认为胃癌组织中存在uPA表达增加，而uPA被认为和癌细胞的转移有关系，同时我们还知道乌司他丁是一个广谱的蛋白酶体抑制剂，在本研究中我们还不能确定乌司他丁是通过uPA的改变来影响细胞凋亡水平，还是通过其蛋白酶体抑制作用来增加顺铂对胃癌细胞的凋亡的作用，这需要进一步的试验进行验证。

总之，本研究证明了联合应用顺铂和乌司他丁能增加人胃癌细胞的死亡率，增加细胞的凋亡的发生。顺铂和乌司他丁联合用药可能提高对抗肿瘤的敏感性，有可能为临床的胃癌患者的化疗提供一种新的治理策略，但是其具体作用途径还需要进一步的试验验证。

[1]Jemal A,Bray F,Center MM,et al.Global cancer statistics[J].CA Cancer J Clin,2011,61(2):69.

[2]Cunningham D,Allum WH,Stenning SP,et al.Perioperative chemotherapy versus surgery -lone for resectable gastroesophageal cancer[J].N Engl J Med,2006,355(1):11.

[3]Sun Z J,Yu T,Chen J S.et al.Effects of ulinastatin and cyclophosphamide on the growth of xenograft breast cancer and expression of CXC chemokine receptor4 and matrix metallproteinse-9 in cancers[J].J Int Med Res，2010，38(3):967.

[4]罗 杰.乌司他丁和泰索帝对人乳腺癌增值、侵袭及uPA、uPAR、ERK表达的影响[D].重庆医科大学硕士论文，2010.

[5]Kelland L.The resurgence of platinum-based cancer chemotherapy[J].Nat Rev Cancer，2007,7(8):573.

[6]王云花.乌司他丁对人结肠癌lovo细胞增值，侵袭，凋亡及HMGB1的影响[D].南方医科大学2011级硕士毕业论文.

[7]李 燕.乌司他丁对人绒毛膜癌uPA表达及侵袭的影响[D].中南大学硕士毕业论文，2010.

[8]程伟华.p-p38和uPA在胃癌组织中的表达及其意义[D].南昌大学医学院硕士毕业论文，2010.

*通讯作者

1007-4287(2017)11-1973-02

张鑫，男，主治医师，硕士研究生，主要从事胃癌的外科治疗方面研究。

2016-07-13)