绿色木霉VKF3中提取的木聚糖酶用于废旧新闻纸的脱墨

绿色木霉VKF3是红树林土壤样品中的木聚糖分解真菌。该研究在不同的碳源、氮源、pH和培育温度下生产绿色木霉VKF3，获得了最佳的木聚糖酶。将椰子油蛋糕作为底物，测得分离后的绿色木霉VKF3所产生的木聚糖酶的最大活性为3.045 IU/mL。在纯化期间，用40%的硫酸盐能获得84%的得率。通过酶谱分析，在14 kDa观察到光谱带，证实了酶的活性。酶剂量30%时的木聚糖酶在培育4 h后最大程度地促进了己烯醛酸释放。另外，随着酶剂量和培育时间的增加，卡伯值呈下降趋势。在酶处理4 h之后，白度增加了11%。通过木聚糖酶的辅助脱墨，纸页的抗张强度、耐破指数以及耐折度等强度性能均有所提升。

制浆造纸行业的化学脱墨会对环境造成一定的污染，而利用生物酶的生物脱墨技术对环境无污染，因此具有更好的发展潜力，但是与化学脱墨法相比，生物脱墨法更具有挑战性。将化学脱墨与生物脱墨相结合，可以降低化学品的使用量。但是要想彻底解决化学品使用过程中的毒性问题，只能通过生物脱墨法来实现。

目前的脱墨过程中，仍依赖于许多对环境有害的化学品，主要是氢氧化钠、硅酸钠、碳酸钠、过氧化氢、螯合剂和表面活性剂等。基于化学品的化学脱墨技术会产生较多的有毒废水，增加COD含量，从而增加废水处理过程的成本。因此，将生物酶作为一种化学品的替代品，如生物漂白过程中使用生物酶作为氯及氯化物的替代品，能够很大程度上减少制浆造纸过程中的许多污染问题。

漂白过程中的最大问题是木质素的去除以及其衍生物与木聚糖和纤维素的结合。有报道称，可以利用通过白腐菌培育的诸多生物酶来降解纸浆中的残留木质素，例如：用于降解木质素的锰过氧化物酶、漆酶以及降解半纤维素的木聚糖酶。在制浆造纸行业中，比起以漆酶为主的木质素降解体系，其实木聚糖酶更适合于漂白。研究人员将内切葡聚糖酶和内切木聚糖酶应用于混合办公废纸的脱墨过程中。在脱墨过程中添加未加工的绿色木霉，结果显示脱墨效果提高了24%，同时纸页的强度也有所提高。另外，实验也发现绿色木霉对于混合办公废纸的脱墨效率更高。

在酶辅助生物漂白过程中，会产生大量诸如八氯二苯并对二噁英的有毒化合物。这种二噁英可能是与木质素相关的有机分子释放出来的，从而通过有机分子前体加速形成八氯二苯并对二噁英。先前的研究认为将生物酶辅助Cl2进行漂白是很高效的，然而最近的研究发现二噁英化合物的产生会限制生物酶的漂白效果；并发现单独使用木聚糖酶而不与氯化物一起共同漂白，能有效地减少二噁英的产生。

目前已经有很多报道关于由不同的微生物来源产生木聚糖酶的菌株，但是这些酶在脱墨过程中效率很低并且稳定性较差。出现这一现象的原因可能是一种反馈机制来抑制了生物酶的活性。因为纸浆中富含碳水化合物，尤其是纤维素，因此需要找到一种更好的生物酶应用于制浆造纸行业。

本实验主要研究从绿色木霉VKF3中提取的木聚糖酶在废旧新闻纸的脱墨效果，并且记录了酶处理过程中的乙烯醛酸的释放量和卡伯值的变化。绿色木霉是一种能够促进植物生长的真菌，因此除去生产木聚糖酶的部分，剩余部分可以用于农业生产。此外，对于在先前的报告中针对所测试植物的真菌中没有检测到植物致病性。

1 实验

1.1 材料

从印度喀拉拉邦的Valanthakad红树林的沉积物样品中分离出绿色木霉VKF3，然后将其接种到马铃薯葡萄糖肉汤中并在（27±2）℃的温度下培育3天。使用100 μm的无菌网过滤真菌，然后滤液在转速5 000 r/min下离心5 min，得到的上清液即为粗酶液。

1.2 木聚糖酶的活性检验

用如下方法来对木聚糖酶的活性进行检测：将0.5 mL的上清液与10%的桦木木聚糖（BWX）1.5 mL混合，然后在量浓度0.1 mmol/L、pH为8.0的磷酸盐缓冲液中培育15 min，培育温度设定为50℃。通过加入2.0 mL二硝基水杨酸试剂（DNSA）终止反应，并进一步在沸水中培育10 min。在540 nm处测定颜色，并通过比较D-木糖标准曲线进行定量。在标准测定条件下与1 μmol木糖每分钟释放的D-木糖相当的还原糖的酶量，被定义为一个单位的木聚糖酶活性。

1.3 优化发酵条件

优化碳源、氮源、pH和培育温度等发酵条件。

使用的真菌基础培养基主要有：K2HPO4（0.20 g/L），KH2PO4（0.18 g/L），NaHPO4（2.0 g/L），NaNO3（3.80 g/L），H3BO3（0.057 mg/L），MnSO4.H2O（5.5 μg/L），CuSO4·7H2O（2.5 μg/L），ZuSO4·7H2O（0.5 mg/L），Fe2（SO4）3·6H2O（5 μg/L），MgSO4·7H2O（5.5 μg/L），NH4NO3（0.60 g/L），（NH4）6MoO24（0.025 mg/L）。 将3%的真菌接种物加入无菌培养基中，并在旋转振荡器上以每分钟150转的速度培育3天。

在第3～11天对酶活进行检测来了解生产性酶动力学。确定最佳碳源之后进一步用于氮源优化；然后在不同的 pH（3、5、7 和 9）和不同温度（25、35、45和55℃）下评估最佳的木聚糖酶生产条件（最佳pH和最佳温度）。

1.4 用于木聚糖酶生产的固体发酵

在多种固体底物上评估生物酶的产生能够降低生产成本。用真菌基础培养基润湿底物，其中并不包括碳源和氮源；然后利用基础培养基将底物的水分保持在20%、30%和50%，并接种3%的真菌接种物；最后将固态培养物在（28±2）℃的温度下培育7天。

通过向固体培养基中加入pH为6.8的磷酸盐缓冲液进行酶液提取，然后使用100 μm的无菌网过滤培养3 h。回收的酶液通过硫酸铵沉淀进行部分纯化。另外还测试了金属离子、还原剂和氧化剂对酶活性的影响，并以百分比来表示残留活性。

1.5 实验方法

1.5.1 木聚糖酶的分子和物理化学表征

采用凝胶电泳表征十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺。用12%的丙烯酰胺凝胶装载粗酶液和蛋白质中间标记物。电泳后，使用考马斯亮蓝染色溶液对凝胶进行染色，然后脱色以显现蛋白条带并确定酶级分的相对分子质量。对于酶谱分析，非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳用补充有1%（W/V）桦木木聚糖的12%丙烯酰胺凝胶进行。电泳之后的凝胶在室温下用0.1%（W/V）的刚果红染液染色30 min。在具有木聚糖酶活性的级分上将清除带进行可视化处理。为了研究金属离子对木聚糖酶活性的影响，在已知量浓度（5、10 和 15 mmol/L）和各种金属离子（K+，Mn2+，Co2+，Fe3+，Cu2+，Zn2+，Mg2+，Hg2+）的条件下，测定所获得的木聚糖酶活性。用阿利纽斯作图法计算酶的活化能。

1.5.2 脱墨实验

使用烘干的废旧新闻纸浆进行脱墨实验，将蒸馏水平均分为几份以获得实验结果的一致性。然后添加不同剂量的粗酶液[20%、30%和50%（W/V）]培育1 h或4 h。将酶处理之后的纸浆在121℃下高温灭活15 min，并在自来水中彻底洗净。在Uni-Vat机器（TARA机械）中使用脱墨纸浆制成再生纸并且在阴凉处干燥。干燥后的纸页进行压光，并进一步分析其改进的亮度、抗张强度、5%溶液的pH、碱度和不透明度。用扫描电镜（SEM）观察酶处理前、后纸浆的纤维的变化。

1.5.3 己烯醛酸量含量和卡伯值的测定

己烯醛酸（HexA）含量和卡伯值是决定纸浆生物漂白效率的关键因素。己烯醛酸是在硫酸盐纸浆蒸煮过程中形成的不饱和化合物，也就是将木聚糖中的4-O-甲基葡萄糖醛酸转化成其相应的不饱和己烯醛酸。由于漂白后对纸浆性能的不利影响，己烯醛酸近年来受到了越来越多的关注。己烯醛酸含量会影响卡伯值、亮度回归、草酸形成、漂白剂的消耗和金属离子的保留，因此在生物漂白过程中测定己烯醛酸的释放量至关重要。

烘干纸浆的己烯醛酸含量的测定如下所示。将0.05 g烘干纸浆用10 mL水解溶液水解，其中含有0.6%的 HgCl2和0.7%的乙酸钠。将反应混合物放入60℃水浴锅中培育30 min。分别在波长260 nm和290 nm处读取溶液的吸光度。根据公式1计算出纸浆的己烯醛酸含量。

式中：V表示水解溶液的体积，mL；W表示烘干纸浆的质量，g。

卡伯值指的是在标准条件下，1 g绝干浆所消耗的量浓度0.1 mol/L高锰酸钾溶液的体积。卡伯值与己烯醛酸含量有一定的联系，因此倾向于卡伯值基于己烯醛酸浓度而增加。用卡伯值的变化来表示纸浆的脱木质素能力和漂白能力。实验中使用的检测标准是 TAPPI T236 om-99（2004）。

2 结果与讨论

2.1 使用绿色木霉VKF3生产木聚糖酶的条件优化

绿色木霉VKF3不仅能够培育纤维素酶，而且也能够用于木聚糖酶的生产。培育3天后，使用培养滤液进行酶测定，发现蔗糖是最优的碳源。另外在室温下培育到第7天时，葡萄糖作为碳源时也能够达到相当的活性。而将木糖作为碳源时，会产生较低的酶活性。值得注意的是将木聚糖作为碳源或诱导剂，由绿色木霉、曲霉菌、哈孜木霉和链霉菌培育的木聚糖酶活性显著增加。将葡萄糖和木糖作为碳源时，对酶的合成会产生不利影响，这种抑制作用可能是在其他酶中发生的分解代谢物抑制机制。但是，将葡萄糖和麦芽糖作为碳源时，木霉表现出了很高的木聚糖酶活性。表1显示了浸没发酵下优化绿色木霉VKF3生产木聚糖酶的因素（表中数据为3次实验的平均值）。

表1 浸没发酵下优化绿色木霉VKF3生产的木聚糖酶酶活 IU/mL

表1表明：当培育到第7天时，蔗糖作为碳源时表现出了最高的酶活，而此时测试的其他碳源的酶活有所下降；当补充尿素作为氮源时，在培育到第5天时木聚糖酶的活性达到最高，但是在第7天时酶活会大幅度的下降。在培育到第5天时，其他的氮源也使酶活达到了最大值，但与含尿素的培养基相比数值还是较低；在对pH进行优化时，发现培育到第7天时酶活达到了最大值；从培育的第3天开始酶活呈指数增长，从第7天起酶活有了小幅度的下降。因此，木聚糖酶的最佳培育时间是7天。使用哈孜木霉培育的木聚糖酶在第7天达到了最大的酶活。在酶活性中观察到的下降趋势可能是由于在发酵培养基中的大量和微量营养素的消耗，其诱导真菌的应激，从而使酶分泌途径失活。

由表1还表明温度也是一个很重要的影响生物酶生产的因素：50℃的温度下培育到第5天时，木聚糖酶达到了最大的酶活。相比于先前的研究，这表明酶具有嗜热性质。

有研究者用木霉来生产木聚糖酶并在第6天时达到了最大的酶活，发现在温度25℃时最大酶活达到了93.5 IU/mL。也有研究人员发现用哈孜木霉生产木聚糖酶时在第8天达到了最大酶活。

2.2 用于木聚糖酶生产的固体发酵（SSF）

与浸没式发酵相比，固体发酵的优点主要是操作简单，生产量高，低污染和产品具有高浓缩性。固体发酵在固体废物管理中起着重要作用，其使用的固体基质通常是农业废物，因此固体发酵过程中固体物质的利用或降解是至关重要的。在固体发酵过程中，真菌利用固体废弃物生长，并进一步给生物酶的生产提供生物能。

目前的研究发现椰子油蛋糕是最优的发酵底物，能使木聚糖酶的活性达到最高，见表2（表中数据为3次实验的平均值）。

表2 绿色木霉VKF3在不同种固体发酵底物下生产木聚糖酶的对比

由表2可见，木聚糖酶的生产与水分含量呈正相关。由于较低的分解代谢阻力，所以与浸没式发酵相比固体发酵能得到更高的酶活，这可能是由于低水分活动而引起的一种缓慢扩散过程。

2.3 木聚糖酶的表征

将底物用磷酸盐缓冲液浸没，然后通过无菌筛网过滤，得到粗酶液。使用硫酸铵进行酶的部分纯化，40%硫酸铵产生最大酶活性，得率为84%，见表3。

表3 木聚糖酶的纯化得率

从绿色木霉VKF3中获得的木聚糖酶在大约66、52、35、22 和 14 kDa处显示出各种频带，见图 1（桦木木聚糖酶作底物）。使用凝胶进行酶谱分析时，将桦木木聚糖做为底物用刚果红染色。这种方法通常用来检测木聚糖分解活性，来识别具有活性的部分。

从分析中观察到在43 kDa至66.0 kDa和14 kDa之间的有2个不同的清除区。在之前的研究中，通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE）和凝胶过滤后估计的纯化木聚糖酶的相对分子质量分别为Xyl I的19 kDa和14 kDa，Xyl II的21 kDa和14.6 kDa。使用阿利纽斯方程计算木聚糖酶的活化能，结果为60.877 kJ/mol。

图1 来自绿色木霉VKF3的木聚糖酶的SDS-PAGE（a）和酶谱分析（b）

2.4 金属离子对木聚糖酶活性的影响

来自绿色木霉VKF3的木聚糖酶活性随金属离子的添加而下降，但是低浓度的K+、Cu2+、Zn2+和Mg2+对酶活几乎没有影响，见表4（表中数据为3次实验的平均值）。

表4 在不同种金属离子下残留木聚糖酶的活性比较

然而目前的研究发现，诸如 Zn2+、Fe2+、Mg2+、Mn2+和Ca2+等金属离子对木聚糖酶的活性会有有利影响；而Cu2+则会使酶活降低。但是，有些木聚糖酶的活性会被Cu2+完全抑制。基本上，金属离子对酶活的抑制或者促进作用，取决于金属离子与蛋白质之间的相互作用。有些金属离子会影响蛋白质的结构从而改变酶促作用。之前的研究发现，金属离子不仅会影响木聚糖酶结合的活性位点，而且也会影响非催化性木聚糖的结合区域，金属离子促进底物的有效水解，从而使酶活性降低。

2.5 木聚糖酶用于废旧新闻纸浆的生物漂白

在脱墨过程中，木聚糖酶被认为是一种优良的生物漂白剂。生物酶的脱墨效率通常由乙烯醛酸的释放以及纸浆中卡伯值的变化所决定。来自绿色木霉VKF3的木聚糖酶被用于了解生物漂白的潜力。将浆样进行不同时间的酶处理，浆料的纤维形态会发生变化。然后用扫描电镜观察酶处理前后纤维形态的变化，见图 2[图中：（a）酶处理后的纤维；（b）对照 -未处理的纤维；（c）酶处理之后纤维表面的裂痕]。

由图2发现，纤维表面明显地出现了与油墨的分离和裂纹，这也与前人的研究发现一致。在1 h和4 h的培育时间里，酶剂量为30%时乙烯醛酸的释放量达到了最大值。然而，培育4 h又能使木聚糖酶达到最高的酶效，见图3。

纸浆的卡伯值也是检验酶效的一个重要因素。在实验中，随着酶剂量和培育时间的增加，卡伯值逐渐下降。通常，卡伯值与乙烯醛酸的释放量呈负相关的关系。在经过二氧化氯处理后，乙烯醛酸的去除率增加了10%。加入木聚糖酶之后，脱木质素提高了9%，ISO白度增加了3%。

在木聚糖酶辅助生物漂白过程中，乙烯醛酸对于化学浆白度的提升有着重要的作用。消除乙烯醛酸对于硫酸盐浆和全无氯（TCF）浆的漂白过程有着积极的意义，从而能够达到更高的白度。而卡伯值则是木浆的残留木质素含量或漂白性的指示性参数。卡伯值因浆料的不同而不同，通常漂白浆的范围是 25～30，袋纸浆的范围是45～55，瓦楞纸板的范围是60～90。此外，由于氧不与乙烯醛酸反应，所以对于六氯丙烷浓度较高的低卡伯纸浆，氧脱木素效率相当低。这也说明乙烯醛酸含量与卡伯值呈负相关，假设纸浆每释放10 mmol/kg的乙烯醛酸，相当于1个卡伯单位。

图2 来自绿色木霉VKF3的木聚糖酶处理前后纤维的SEM照片

图3 来自绿色木霉VKF3的木聚糖酶处理后纸浆乙烯醛酸含量和卡伯值的对比

经过酶处理之后，发现由脱墨纸制成的再生纸的白度有了一定的提高，见表5。

表5 来自绿色木霉VKF3的木聚糖酶生物漂白效果

由表5可见，在经过酶处理1 h和4 h后，白度分别提高了9百分点和11百分点。经过1 h的酶处理之后抗张强度有所提高，但是酶处理4 h后抗张强度呈下降的趋势。与空白样品相比，不透明度也有一定的提高。另外，经过酶处理之后pH和碱度并没有很明显的变化。

3 结论

（1）绿色木霉 VKF3是用于生产生物脱墨工艺的木聚糖酶的很有潜力的一种分离菌。

（2）固态发酵提供了具有成本效益且易于生产的酶。

（3）废旧新闻纸浆经酶处理4 h后能达到最佳的白度。

（4）回收纸浆的相关物理性能即使在酶处理之后也不会下降。

（5）卡伯值和乙烯醛酸的释放量呈负相关，有助于在酶脱墨过程中达到38%的最大白度。

（管 敏 编译）

2018年《造纸装备及材料》征订启事

《造纸装备及材料》是为造纸装备制造企业、材料制造企业专业服务的期刊，国内统一刊号CN 43-1535/TS，国际连续出版物刊号：ISSN 2096-3092，全国公开发行。（今年是46卷，季刊，大16开版）

为了更好地服务于造纸装备制造企业、材料制造企业，本刊编入了全新栏目：造纸装备及材料制造企业风采；装备与自动化；材料制造和应用；造纸装备、材料产品及专利介绍；造纸装备、材料项目简讯等。

欢迎在上述栏目投稿、宣传企业文化及产品。本刊特惠为企业服务，欢迎加盟协办期刊。

欢迎订阅，46元/年，欢迎发邮件或来电咨询。

邮箱：paperem@163.com 电话：0731-58523295

《精细化工》2018年征订启事

《精细化工》月刊为每月15日出版、国内外公开发行，是中国化工学会精细化工专业委员会和中国精细化工协会（筹）会刊。主办单位为中昊（大连）化工研究设计院有限公司、中国化工学会精细化工专业委员会。

《精细化工》是中国百种杰出学术期刊、中国精品科技期刊、中文核心期刊、RCCSE中国权威学术期刊、中国科技核心期刊；是国内创办最早的精细化工专业技术刊物。是EI收录期刊、美国《化学文摘》（CA）、日本《科学技术文献速报》（CJST）、俄罗斯《文摘杂志》（РЖ）、美国《剑桥科学文摘》（CSA）收录期刊。国内统一刊号：CN 21-1203/TQ；国际标准刊号：ISSN 1003-5214。

《精细化工》报道范围，涉及当代中国精细化工科学与工业的众多新兴领域，主要栏目有：功能材料、电子化学品、生物工程、催化与分离提纯技术、表面活性剂、食品与饲料添加剂、香料与香精、医药与日化原料、有机电化学合成与工业、皮革化学品、淀粉衍生物、造纸化学品、水处理技术、特种染料与颜料、橡塑助剂、纺织染整助剂、中药现代化技术、粘合剂、油田化学品与油品添加剂、建筑用化学品、丙烯酸系列化学品、精细化工中间体等。

《精细化工》定价35元/期，全年订价420元，国内邮发代号：8-55，全国各地邮政局（所）均可订阅；国外总发行：中国国际图书贸易总公司(北京399信箱)，国外发行代号：4624 M。本刊编辑部随时办理补订业务。http://www.finechemicals.com.cn

邮局汇款地址：大连市高新园区黄浦路201号邮编：116023

收款人：《精细化工》编辑部

电话：0411－84699773 E-mail：jxhgbjb@126.com银行汇款请汇至

开户行：工商银行大连星海支行

账号：3400202309008902113

收款单位：中昊（大连）化工研究设计院有限公司

汇款请务必注明汇款目的