顾蓓蓓 卢劲晔 马 卉 卢 炜 周伟伟

（1.泰州出入境检验检疫局，江苏泰州 225300；2.江苏农牧科技职业学院，江苏泰州 225300）

中性粒细胞在大肠杆菌感染大鼠乳腺损伤中的作用机制

顾蓓蓓1卢劲晔2*马 卉1卢 炜2周伟伟1

（1.泰州出入境检验检疫局，江苏泰州 225300；2.江苏农牧科技职业学院，江苏泰州 225300）

36只清洁级SD怀孕大鼠于产后72h经乳头管灌注2×1012CFU/ml大肠杆菌悬液100μL/侧到第四对乳腺（两侧）内。分别于灌注前（定义为0h）及灌注后12、24、48和72h（n=6）颈静脉放血处死动物，采集样品。结果显示大肠杆菌诱发乳腺炎引起细胞间粘附分子-1（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）和中性粒细胞趋化因子（cytokineinduced neutrophil chemoattractant-1，CINC-1）表达显著升高，从而促进嗜中性粒细胞（neutrophil，PMN）迁徙及活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）的释放，同时伴随着乳腺组织丙二醛（MDA）含量的显著升高。结果表明活化的PMN向乳腺组织迁徙是大肠杆菌乳腺炎的主要特征，PMN迁徙至感染部位通过释放ROS消灭病原菌，同时也是引起组织损伤的重要原因。

中性粒细胞；大肠杆菌；乳腺炎；大鼠

乳腺炎在各种乳用家畜甚至是人类普遍存在，奶牛乳腺炎更是频繁发生。据报道，全世界约有1/3的奶牛罹患有各种类型的乳腺炎，是危害奶牛产业的一种重要疾病之一。乳腺炎诱发因素众多，其中以病原菌感染最为重要，根据病原来源和传播方式可分为传染性病原和环境性病原两大类。大肠杆菌是环境性病原的代表，感染大肠杆菌后常引起急性乳腺炎，并伴随局部和全身症状[1]。近年来大肠杆菌乳腺炎发病率有升高的趋势，特别是在一些饲养管理水平较高的发达国家，接触性乳腺炎有所控制，而大肠杆菌乳腺炎在临床型乳腺炎中的发病率有所增加。大肠杆菌多在干乳期感染乳腺（干乳后两周到产前两周是最易感期），而在分娩后两周内表现出临床症状，围产期乳腺感染的易感性（IMI）明显升高，可能与围产期先天免疫防御系统受到抑制密切相关[2]。治疗和预防围产期的大肠杆菌乳腺炎已成为目前奶牛业面临的主要挑战之一。

机体的天然免疫系统有非特异性和特异性两套防御机制，非特异性防御机制的发挥依赖和病原微生物持续性作用，并且其杀伤效果取决于微生物的种类[2]。在乳腺防御体系中，组成型的防御机制主要有物理屏障（乳腺上皮屏障）、乳腺内的防御细胞（包括各种粒细胞、单核/巨噬细胞、自然杀伤细胞）和体液中的抗菌酶、溶菌酶等。现有的研究证实活化的中性粒细胞（PMN）作为非特异性细胞免疫系统的成分之一，在乳腺炎的发生、发展和转归进程中发挥了重要的作用。致病菌入侵乳腺后在趋化因子的作用下血液中大量的PMN激活并向乳腺组织迁移，通过释放大量活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）杀灭病原微生物，ROS是分子氧在还原过程中的一系列代谢中间产物，主要包括O2-、H2O2、HOCl、·OH等[3]。在对一些胞内感染菌的研究中发现，ROS的产生对清除胞内微生物是必需的，但持续过度激活，产生过量氧化剂超过局部抗氧化剂的防御反应时，能降解蛋白多糖，减少细胞外基质与乳腺上皮的粘附性，引起乳腺上皮细胞死亡、脱落和泌乳功能的损伤[4]。因此深入了解PMN在宿主抗乳腺感染过程中的作用具有重要的意义。

1 材料与方法

1.1 细菌

乳腺炎致病菌大肠杆菌（Escherichial coli）由南京农业大学动物医学院泌乳生化教研室提供。大肠杆菌经肉汤培养基复壮后在普通营养琼脂平板分离成单个菌落，实验前挑取单个菌落于肉汤培养基中37℃培养24h，无菌取100μL均匀涂抹在琼脂糖平板上，37℃培养24h后刮取菌苔，溶解于灭菌磷酸盐缓冲液（PBS）中，3000rpm离心10min，连续3次，用平板稀释计数法调整浓度至2×1012CFU/ml。

1.2 实验动物

36只清洁级怀孕SD大鼠，购自上海实验动物中心。产后72h诱发试验性乳腺炎，经乳头管注入2×1012CFU/ml大肠杆菌悬液100μL/侧到大鼠第四对乳腺（两侧）内。分别于灌注前（定义为0h）及灌注后12、24、48、72h（n=6）颈静脉放血处死动物，收集血清、肝素抗凝血及乳腺组织用于后续分析。

1.3 主要试剂及仪器

TRIzol购自Invitrogen公司；RNA酶抑制剂、随机引物、M-MLV、dNTPs购自Promega公司、SYBR® Green PCR Master Mix购自Toyobo公司；丙二醛（malondialdehyde，MDA）试剂盒购于南京建成生物工程研究所；乙酸肉豆蔻佛波酯（Phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA）、双氢罗丹明（dihydrorhodamin，DHR 123）购自Sigma公司。

UV755B型分光光度计（上海精密科学仪器有限公司），光学显微镜（日本奥林巴斯BH2），组织匀浆器（瑞士Kinematica AG），核酸浓度测定仪（德国Eppendorf Biophotometer），荧光定量PCR仪（ABI Prism 7300），流式细胞仪（美国BD Biosciences）。

1.4 测定指标及方法

1.4.1 荧光定量PCR检测乳腺组织细胞间粘附分子-1（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）、中性粒细胞趋化因子（cytokine-induced neutrophil chemoattractant-1，CINC-1）mRNA表达TRIzol试剂盒提取总RNA，用随机引物同时对所有样品进行反转录，建立各样品的cDNA。用所有待测RT产物的混合样对反应条件进行优化。反应条件为95℃ 1min预变性；95℃20s，62℃30s，72℃20s，重复45个循环。基因引物参考已发表的文献。数据分析采用2-△△Ct法。

表1 荧光定量PCR引物序列

1.4.2 乳腺组织与血清中MPO、MDA的测定

乳腺组织：准确称取1g乳腺组织加入生理盐水6ml，冰浴匀浆后于3000rpm 4℃离心30 min，吸取上清液，分装，-20℃冰箱保存备用。使用前用Bradford法测定蛋白浓度。

血清：大鼠采集血液后4℃过夜，待完全凝固后，3000rpm离心10min，吸取上清液，分装，-20℃冰箱保存备用。

MDA活性按试剂盒说明书操作。

1.4.3 流式细胞术测定外周血PMN活性氧释放

100μL全血加入终浓度为100ng/ml PMA刺激PMN，同时设无PMA刺激对照（等量PBS代替PMA）；37℃ 15min后加入DHR123工作液，终浓度为5μmol/L，37℃孵育10min；裂解红细胞，0.01mol/L、pH7.2 PBS洗涤两次并重悬于PBS中，混匀后流式细胞仪检测，依次检测无刺激对照和PMA刺激样品，每个样品获取10000个细胞，重复三次，结果以平均荧光强度给出。

1.5 数据处理

用SPSS17.0方差分析程序对试验数据进行统计分析，统计结果以平均数±标准误（Mean±SE）表示。

2 结果与分析

2.1 乳腺组织ICAM-1和CINC-1 mRNA表达的变化

图2-1 乳腺组织ICAM-1和CINC-1 mRNA表达的变化

试验结果显示，乳腺组织中ICAM-1和CINC-1 mRNA相对表达在乳腺灌注大肠杆菌后各个时间点均显著升高（P ＜0.05）。ICAM-1 mRNA表达第72h尽管仍显著高于0h，但与48h相比明显下降。CINC-1 mRNA表达趋势相同，灌注后第48h已开始急剧下降。

2.2 外周血中性粒细胞活性氧释放的动态变化

图2-2 外周血中性粒细胞活性氧释放的动态变化

大肠杆菌灌注乳腺后12、24、48h外周血PMN活性氧释放均显著升高（P ＜0.05），峰值出现在第24h，第72h已恢复至正常水平。

2.3 乳腺组织和血清中MDA水平

图2-3 大鼠血清和乳腺组织中MPO活性的变化

诱导乳腺炎后12、24和48h，乳腺组织中MDA水平显著升高，峰值出现在第24h，到72h基本恢复至正常水平。血清中MDA水平在第24h显著升高，其他时间点与0h相比差异不显著。

3 讨论

作为机体最大的外分泌腺，乳腺在进化、发育和泌乳再构建的过程中时刻面临着病原微生物的侵袭。乳腺感染在各种乳用家畜甚至是人类（尤其是发展中国家）普遍存在，奶牛乳腺炎更是频繁发生，是制约奶牛产业发展的主要疾病之一，每年因乳腺炎造成的经济损失高达350亿美元。

大量循环血液中的PMN在病原微生物或其他活性分子的作用下向乳腺组织迁徙，是乳腺炎发生时的重要特征。已有研究表明，细菌入侵后通过激活NF-κB/AP-1刺激单核、巨噬细胞产生多种趋化因子促进吞噬细胞如PMN的趋化[5]。ICAM-1属于免疫球蛋白超家族的成员，广泛表达于各种细胞表面，在细胞间的相互作用以及白细胞粘附聚集中起着重要作用[6]。CINC-1则是炎症发生时一种重要的趋化因子，能促进吞噬细胞迁徙，对PMN有激活作用，可以诱导其变形、趋化、脱颗粒、合成生物活性脂类、整合素上调以及呼吸爆发等[7]。试验结果表明大肠杆菌诱导试验性乳腺炎后乳腺组织中的ICAM-1和CINC-1表达显著升高，表明细菌入侵后通过表达促炎因子和趋化因子，诱导PMN趋化进入病灶发挥吞噬活性。

PMN是机体抵抗感染的主要非特异性防御细胞，PMN进入病灶通过释放ROS清除病原微生物，在对一些胞内感染菌的研究中发现，ROS的产生对清除胞内微生物是必需的[8]，本研究结果显示，大肠杆菌灌注乳腺后ROS显著升高，表明ROS是宿主抵御乳腺感染的主要效应分子。但是过度释放的高毒性ROS在杀灭病原微生物的同时会损伤组织细胞。本研究结果显示ROS释放的峰值伴随着MDA的显著增加，MDA作为脂质过氧化代谢的产物，其水平高低间接反映机体细胞受自由基攻击的严重程度。大肠杆菌灌注后第12、24、48h乳腺组织中MDA含量急剧升高，第24h达到峰值，第72h恢复至正常水平。

4 小结

病原微生物或其他活性分子刺激乳腺组织后，在趋化因子的作用下，循环血液中的PMN向乳腺组织迁徙，释放活性氧消灭病原微生物，但亦是引起乳腺组织的损伤的主要原因。因此如何迅速的启动机体的免疫反应，促进PMN等效应细胞第一时间迁徙至病灶组织发挥吞噬效应，并迅速从乳腺腺泡清除是乳腺炎防控的根本所在。本研究深入探讨了宿主识别和清除乳房致病因子感染的天然免疫机制，为临床上乳腺炎的免疫调控及防治具有重要的现实意义。

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江苏省自然科学基金面上研究项目（编号：BK20151354）；江苏农牧科技职业学院科研课题（编号：NSF201609）；江苏省现代畜牧与新兽药工程技术中心开放课题（编号：TGC2XKF1402）；江苏高校品牌专业建设工程项目（PPZY2015C230）。

顾蓓蓓（1983—），江苏兴化人，博士，研究方向：乳腺炎的营养免疫调节机制研究。

卢劲晔（1983—），江苏邗江人，博士。